圖 9G 及 9H顯示為分別封裝於AAVHSC15衣殼內之遊離轉基因表現載體及PAH-006m-LP-1按指定劑量對PAHenu2小鼠中所檢測到的每10 ng總RNA之mRNA表達含量的影響的圖。 圖 9I顯示為按指定在給予封裝於AAVHSC15內之載體劑量後第12週，由ddPCR在如所指定之不同劑量檢測到之每個等位基因的病毒基因體數目所呈現之靶上整合含量的圖。 圖 9J顯示為按指定在給予封裝於AAVHSC15內之載體劑量後第12週，如所指定不同劑量檢測到的靶上插入頻率的圖。 圖 9K 及 9L顯示為給予PAHenu2小鼠載體及所指定劑量後，部分肝切除術對血清Phe含量到42週（圖 9K）或40週（圖 9L）之影響結果的時程圖。 圖12A及12B顯示以劑量為1E14 vg/kg施用封裝於AAVHSC15衣殼內之PAH-006m-LP-1之PAHenu2小鼠載體基因體含量（圖12A）及PAH轉基因mRNA表達含量（圖12B）的時程。 人類設計載體包含人類同源臂序列且由於序列差異將不會期望通過同源重組整合至小鼠基因體中，因此在這些實驗中人類設計載體僅作爲遊離基因的控制組。
在某些實施例中，編輯元件包含PAH編碼序列（例如完整的PAH編碼序列）。 本文提供可恢復細胞中之PAH基因功能的重組腺相關病毒組成物，及使用其治療與PAH基因功能降低相關之疾病（例如PKU）的方法。 還提供了核酸、載體、封裝系統以及製造該腺相關病毒組成物的方法。
在標準AAV施用條件下，在缺少外源性核酸酶的情況下當向植入有人類肝細胞的小鼠施用AAV時，該編輯元件整合到靶基因座的效率至少為1%。 在某些實施例中，在標準AAV施用條件下，在缺少外源性核酸酶的情況下當向植入有人類肝細胞的小鼠施用AAV時，該編輯元件整合到靶基因座的等位基因頻率至少為0.5%。 分子療法 分子療法2025 本文提供可恢復細胞中之苯丙胺酸羥化酶基因功能的重組腺相關病毒組成物，及使用其治療與PAH基因功能降低相關之疾病（例如PKU）的方法。
野生型及編輯的序列的每個數目通過計數涵蓋同源臂及插入基因或未編輯野生型序列之任一者交界處的序列數目來統計。 藉由使用此NGS方法，可檢測到每個等位基因總數目的靶插入百分比，且另外，可以收集整個插入位點序列使得檢測到原發突變（例如不正確插入及缺失事件及ITR整合）。 在封裝系統之某些實施例中，輔助病毒選自由以下組成之羣：腺病毒、皰疹病毒（包括單純皰疹病毒）、痘病毒（諸如牛痘病毒）、巨細胞病毒及桿狀病毒。 在封裝系統之某些實施例中，其中輔助病毒為腺病毒，腺病毒基因體包含一或多種選自由以下組成之羣的腺病毒RNA基因：El、E2、E4及VA。
一種用於製備rAAV之封裝系統，其中該封裝系統包含： 第一核苷酸序列，其編碼一或多種AAV Rep蛋白； 第二核苷酸序列，其編碼如請求項1至70中任一項之rAAV的衣殼蛋白；及 第三核苷酸序列，其包含如請求項1至70中任一項之rAAV的rAAV基因體序列。 如請求項1至69中任一項之rAAV，其中在標準AAV施用條件下，在缺少外源性核酸酶的情況下當向植入有人類肝細胞的小鼠施用AAV時，該編輯元件整合到該靶基因座的等位基因頻率至少為0.5%。 如請求項1至68中任一項之rAAV，其中在標準AAV施用條件下，在缺少外源性核酸酶的情況下當向植入有人類肝細胞的小鼠施用AAV時，該編輯元件整合到該靶基因座的效率至少為1%。 圖 12A-12C顯示為以劑量1E14 vg/kg施用封裝於AAVHSC15衣殼內之小鼠特異性基因轉移／基因編輯AAV載體(PAH-006m-LP-1)的PAHenu2小鼠隨時間推移之動能及耐久性的圖。 圖 12A 及 12B顯示為封裝於AAVHSC15衣殼內之PAH-006m-LP-1隨時間推移分別對在PAHenu2小鼠中每ug基因體DNA所檢測到的載體基因體含量及每10 ng總RNA所檢測到的之mRNA表達含量的影響的圖。 圖 12C顯示為在給予封裝於AAVHSC15衣殼內之PAH-006m-LP-1劑量後不同時間點所檢測到的靶上插入頻率的圖。
鑒於同源重組可能由載體的同源臂及基因體中脫靶位置之間的短延伸序列相似性所驅動，開發了基於PCR測定法以具體地測試整合至包含類似於同源臂之序列的基因體區域。 此方法在生物信息上預測最有可能的區域，以在轉導了包含對人類PAH基因座具有特異性之同源臂之載體的人類細胞中進行脫靶同源重組。 基於PCR的方法被設計成專門檢測在預測區域中任何發生脫靶整合的轉導樣本。 使用這種基於PCR的方法能夠檢測到含量為1∶10000DNA分子之整合。 食蟹獼猴在PAH基因座與人類同源臂序列PAH-032h呈現94.2%序列一致性。 為了判定PAH-032h對於人體PAH基因座的特異性，評估了原生食蟹獼猴及原生人類肝細胞混合物中PAH-032h編輯PAH基因座的能力。
在另一態樣中，本發明提供本文中所描述之rAAV，其係用於如本文中所描述之用於在細胞中表現芳基硫酸酯酶A（ARSA）多肽之方法中。 因此，本領域中需要經改良之基因療法組成物及方法，其可有效及安全地恢復MLD患者中之ARSA基因功能。 分子療法 異染性白質失養症（MLD）為具有較高的未滿足之醫學需求之致死性溶酶體貯積病。
圖 9B為顯示在以所指示之劑量靜脈內投與封裝於AAVHSC15衣殼中之轉移載體pHMI-5000之後，ARSA（-/-）小鼠之大腦中之以每個細胞計的載體基因組之數目之圖。 圖 9C為顯示在給藥後12週之過程中，投與4e13 vg/kg之封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5000的新生ARSA（-/-）小鼠中之hARSA酶活性水準之圖。 圖 9D為顯示投與4e13 vg/kg之封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5000的成年ARSA（-/-）小鼠之大腦中之ARSA酶活性水準（經由hARSA轉錄物分析）之圖。 圖 9E為顯示在投與單次靜脈內4e13 vg/kg之劑量的封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5000之ARSA（-/-）小鼠之大腦中，以每微克基因組DNA計的載體基因組之數目之圖。 圖 9F為顯示在投與單次靜脈內4e13 vg/kg之劑量的封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5000之ARSA（-/-）小鼠之大腦中，以每奈克RNA計的ARSA轉錄物之複本之數目之圖。
如請求項1至34中任一項之rAAV，其中該5’同源臂核苷酸序列與該第一基因體區域至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致。 圖 13A 及 13B顯示為封裝於AAVHSC15之hPAH-hI1C-032-LP1-SD3分別對每ug基因體DNA所檢測到之載體基因體含量及自HuLiv小鼠分離的人類肝細胞中每10 ng總RNA所檢測到的mRNA表達含量的影響的圖。 圖 13C顯示為，依所指定劑量給予封裝於AAVHSC15之hPAH-hI1C-032-LP1-SD3後於不同時間點自HuLiv小鼠分離的人類肝細胞中所檢測到靶上插入頻率的圖。 在以人類設計載體處理之小鼠中，血清Phe含量在施用載體後的一週時間點減少（圖11B）。 對於經處理之第4及10週齡小鼠（第10組及第11組），Phe含量之減少維持經過43週，顯示對治療反應的長期耐久性。 在經處理之2週齡小鼠（第9組），經過30週Phe含量維持在≤360 µM之臨牀相對含量。
在某些實施例中，個體細胞從轉導細胞羣體分離並經受單細胞PCR，PCR引子可以識別存呈現之編輯元件正確地整合到PAH基因的靶基因座中。 這種方法可進一步包含相同細胞的單細胞PCR，其使用會選擇性地放大未修飾之靶基因座的PCR引子。 舉例來說，如果單細胞PCR顯示細胞具有編輯靶基因座及未修飾的靶基因座兩者，則該細胞在經編輯的PAH基因中將被視為異形合子。 在某些實施例中，當正確地藉由同源重組在靶基因座中整合，編輯元件把包含至少一部分PAH編碼序列的核苷酸序列插入至PAH基因中。
圖 8為顯示在靜脈內（IV）或鞘內（IT）投與封裝於AAVHSC15中之轉移載體pHMI-5000之後，後腦及中腦中之正常人類ARSA酶活性之百分比之圖。 根據表4及5中所闡述之實驗設計向非人類靈長類動物（NHP）投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5005。 在第0天，經由經頭部/隱靜脈進行1-2分鐘緩慢推注靜脈內注射（IV）或直接注射至大池（CM）中來進行投藥。 在每天上午以及在給藥當天在完成給藥之後（15分鐘）及給藥後4小時進行臨牀觀測。 在即將給藥之前以及在給藥後第1、2及4週獲得用於血液學及臨牀化學之血液。 在第28及29天之屍檢時，在腦脊髓液（CSF）及血液收集之後，向動物灌注1.0 分子療法 L低溫生理食鹽水以移除血球。
在某些實施例中，核苷酸長度的不對稱性是由5’及3’同源臂在長度上高達90%的差異所定義的，例如長度差異高達80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%或10%。 在某些實施例中，5’同源臂具有約50至約4000核苷酸的長度（例如約100至約3000、約200至約2000、約500至約1000核苷酸）。 分子療法2025 在某些實施例中，3’同源臂具有約50至約4000核苷酸的長度（例如約100至約3000、約200至約2000、約500至約1000核苷酸）。 在某些實施例中，5’及3’同源臂中的每一者獨立地具有約50至約4000核苷酸的長度（例如約100至約3000、約200至約2000、約500至約1000核苷酸）。
如請求項1至70中任一項之rAAV、如請求項71之醫藥組成物或如請求項72之多核苷酸，其用於治療患有PKU之個體的方法，該方法包含向該個體施用有效量之該rAAV、該醫藥組成物或該多核苷酸。 一種用於治療患有苯丙酮尿症之個體的方法，該方法包含向該個體施用有效量之如請求項1至70中任一項之rAAV、如請求項71之醫藥組成物或如請求項72之多核苷酸。 如請求項1至41中任一項之rAAV，其中該5’及3’同源臂核苷酸序列中的每個獨立地具有約100至約2000之核苷酸長度。 如請求項1至36中任一項之rAAV，其中該第一基因體區域係位於第一編輯窗中，以及該第二基因體區域係位於第二編輯窗中。 圖 8A-8C顯示為隨時間推移在PAHenu2小鼠中PAH-006m-LP-1對血液Phe濃度之影響的圖。 圖 8A顯示全數據集，而圖 8B顯示在某時間範圍內具有減少的y軸刻度的數據，以顯示劑量之間差異。
在另一態樣中，本發明提供一種用於重組製備rAAV之方法，該方法包括將本文所描述之封裝系統引入至細胞中，在該條件下由此產生rAAV。 在某些實施例中，靶基因座5’端之核苷酸係在PAH基因的內含子中。 分子療法 在某些實施例中，靶基因座5’端之核苷酸係在PAH基因的內含子1中。
- 本文所揭示之方法尤其有利，在於其可在活體內以及活體外皆高效地在細胞中編碼PAH基因。
- 在某些實施例中，個體細胞從轉導細胞羣體分離並經受單細胞PCR，PCR引子可以識別存呈現之編輯元件正確地整合到PAH基因的靶基因座中。
- 在PAH基因座上之靶上整合含量使用如實例2所述之ddPCR連鎖測定法測量。
- 在PAH基因座靶上插入含量使用如上方材料及方法所述之ddPCR連鎖測定法測量。
- 如請求項1之方法，其中該細胞為神經元及/或神經膠細胞，視情況其中該細胞為中樞神經系統及/或周邊神經系統之神經元及/或神經膠細胞。
- 如本文中所使用，術語「聚腺苷酸化序列」係指在轉錄至RNA中時組成聚腺苷酸化信號序列之DNA序列。
- 異染性白質失養症（MLD）為具有較高的未滿足之醫學需求之致死性溶酶體貯積病。
- 野生型及編輯的序列的每個數目通過計數涵蓋同源臂及插入基因或未編輯野生型序列之任一者交界處的序列數目來統計。
在向ARSA（-/-）小鼠靜脈內投與封裝於AAVHSC15中之pHMI-5000之後，在重要的中樞神經系統區域中存在抗ARSA免疫反應性。 廣泛偵測到抗小鼠ARSA（mARSA）或人類ARSA（hARSA），包括（但不限於）運動及感覺皮質、海馬區（CA3區域）、殼核及小腦。 在封裝於AAVHSC15中之轉移載體pHMI-5000之IV或IT投藥之後，後腦及中腦中之正常人類ARSA酶活性之百分比之定量顯示於圖8中。 此實例提供與人類ARSA轉移載體pHMI-5000之用途相關之實驗資料。
也觀察到給予封裝於AAVHSC15衣殼內之人類設計載體（圖10H）或小鼠設計載體（圖10G）劑量之4週齡小鼠肝臟中所檢測到的mRNA含量有劑量反應。 在PAH基因座上之靶上整合含量使用如實例2所述之ddPCR連鎖測定法測量。 分子療法 分子療法2025 圖9I顯示所示不同劑量的PAH-006m-LP1及遊離轉基因表達載體在給予劑量第12週後靶上整合數量（由ddPCR所檢測的每個PAH等位基因測量的病毒基因體）。
此方法可進一步包含額外的qPCR或ddPCR（在相同反應亦或分別反應）以判定在樣品中的總基因體數目及未編輯的PAH等位基因數目。 本文所揭示之rAAV基因體所使用的同源臂可直接傳送到PAH基因的任何區域或基因體附近的基因。 準確的一致性及同源臂位置由編輯元件及/或靶基因座的一致性判定。 分子療法2025 分子療法2025 在某些實施例中，rAAV基因體進一步包含至少一部分PAH編碼序列5’端的內含子元件。
圖 9A 及 9B顯示為分別封裝於AAVHSC15衣殼內之遊離轉基因表現載體及PAH-006m-LP-1按指定劑量給予劑量最長12週後對PAHenu2小鼠之血清Phe含量影響的圖。 圖 9C 及 9D顯示為分別封裝於AAVHSC15衣殼內之遊離轉基因表現載體及PAH-006m-LP-1按指定劑量給予劑量最長12週後對PAHenu2小鼠之血清Tyr含量影響的圖。 圖 9E 及 9F顯示為分別封裝於AAVHSC15衣殼內之遊離轉基因表現載體及PAH-006m-LP-1按指定劑量對PAHenu2小鼠中每ug基因體DNA所檢測到的載體基因體含量的影響的圖。
如前述請求項中任一項之方法，其中該轉移基因組進一步包含該基因組的5’之5’反向末端重複（5′ ITR）核苷酸序列，及該基因組的3’之3’反向末端重複（3′ ITR）核苷酸序列。 如前述請求項中任一項之方法，其中該轉移基因組進一步包含位於該以緘默方式改變之ARSA編碼序列3’之填充序列。 在封裝系統之某些具體實施例中，第一、第二及/或第三載體包含於一或多種重組輔助病毒內。 在某些具體實施例中，第一載體及第三載體包含於重組輔助病毒內。
在某些實施例中，待轉導之細胞在哺乳動物個體中且AAV以可有效轉導個體中之細胞之量向個體施用。 因此，在某些實施例中，本發明提供一種用於治療患有與PAH基因突變相關之疾病或病症之個體的方法，該方法一般包含向個體施用有效量的如本文所揭示之rAAV。 個體可為人類個體或含有人類肝臟細胞之嚙齒動物個體（例如小鼠）。 適合的小鼠個體包括但不限於已植入人體肝臟細胞(例如人類肝細胞)的小鼠。 與PAH基因突變相關之任何疾病或病症可使用本文所揭示之方法治療。