培養完成後，使用磷酸鹽緩衝液清洗各細胞並使用SA-β-gal套組進行細胞老化的評估。 腎臟細胞 ARPE-19的實驗結果請參考表6及圖1A及圖1B，圖1A及圖1B顯示使用實施例之細胞培養組合物培養ARPE-19的細胞增生率，圖1A之培養時間為24小時，圖1B之培養時間為48小時。 HepG2的實驗結果請參考表7及圖2，圖2顯示使用實施例之細胞培養組合物培養HepG2的細胞增生率，培養時間為24小時。
- 在貧瘠的培養基中或是嚴苛的培養條件下，細胞成長的速率較慢，生長出來的細胞可能較脆弱、不易存活，甚至無法成長。
- 進行細胞培養時，根據細胞種類選用適當的培養基，接著依期望濃度加入所需之營養添加物以及如上所述之粒線體並混合均勻即可使用。
- 本發明實施例提供一種細胞培養組合物及其用途，細胞培養組合物包含培養基以及粒線體。
- 接著，移除培養皿中的杜氏磷酸鹽緩衝液後，在培養皿中加入細胞剝離用之胰蛋白酶（Trypsin），並在37℃下反應3分鐘後，再加入幹細胞培養液以終止反應。
- 如請求項1所述的細胞承載裝置，其中，該聚氨酯是使聚醚多元醇與脂肪族多異氰酸酯反應，接著與鏈延長劑反應而得。
- 該彈性膜2為上述製得的聚氨酯彈性膜，且該彈性膜2上附著有附著型細胞9(大小僅為示意)，可供模擬細胞在會頻繁拉伸的肌肉或皮膚表面之動態生長環境。
實施例8-3及實施例8-4證實在粒線體濃度皆為40 μg/mL的情況下，添加1×106個/mL之血小板可使細胞增生率進一步提升。 實施例8-4及對照組8-1證實在血小板數量皆為1×106的情況下，添加40 μg/mL之粒線體可使細胞增生率超過血小板數量為1×108（對照組8-3）始能達到的效果。 腎臟細胞2025 因此，相較於僅添加血小板或僅添加粒線體的細胞培養組合物，同時含有粒線體及血小板的細胞培養組合物在提升細胞增生率上可具有加乘的效果。 並且，增生率的提高隨培養時間增長而更加明顯，表示含有粒線體的細胞培養組合物可穩定幫助細胞生長。 於此，特別說明，實施例8-4之48小時增生率略低於實施例8-3之48小時增生率，原因在於細胞已生長至飽和，細胞生長至飽和時細胞總數應略為相等，故細胞生增生率的差異不明顯。
腎臟細胞: TWM517199U – 細胞承載裝置及細胞培養系統
以下實施例係進一步詳細說明本發明之觀點，但非以任何觀點限制本發明之範疇。
一種細胞承載裝置，包含：一彈性膜，用以承載細胞；一支撐結構，固定在該彈性膜周緣；及至少一孔道，連通至該彈性膜底部，以施加應力於該彈性膜，其中，該彈性膜的材質為聚氨酯。 現有可提供動態環境以觀察細胞的裝置是使用一具有彈性的矽膠膜，並透過機械或流體施加外力，使承載在該矽膠膜上的細胞接受到動態刺激。 然而，在長期使用下，該矽膠膜往往會因為彈性疲乏而降低裝置的耐用程度。 如請求項5所述的細胞承載裝置，其中，該脂肪族多異氰酸酯是選自於異佛酮二異氰酸酯、1,6-己二異氰酸酯或其組合。 如請求項1所述的細胞承載裝置，其中，該聚氨酯是使聚醚多元醇與脂肪族多異氰酸酯反應，接著與鏈延長劑反應而得。
腎臟細胞: TW202200781A – 細胞培養組合物及其用途
圖6至圖7中，縱軸為老化細胞比例（%），#表示相對對照組具有顯著差異（P＜0.05），##表示相對對照組具有高顯著差異（P＜0.01），###表示相對對照組具有非常顯著差異（P＜0.001）。 使用不含粒線體的培養液，將幹細胞培養至其體積為培養皿的八分滿時，移除培養皿中的培養液並使用磷酸鹽緩衝液（phosphate buffered saline，PBS）潤洗幹細胞。 接著，在培養皿中加入0.25%之胰蛋白酶並使胰蛋白酶在37℃下反應5分鐘，再加入培養液以終止胰蛋白酶的反應。 接者，將培養皿中的各細胞及培養液移至離心管中，以每分鐘轉速1000（Revolutions Per Minute，rpm）離心5分鐘後，移除上清液。
- 體細胞可包含視網膜細胞、肝臟細胞、腎臟細胞、肌腱細胞、皮膚細胞或免疫細胞。
- 培養出的細胞若是不夠健康或是成長的速度過慢，對後續的實驗或研究皆會造成不利的影響。
- 初始對照組為細胞剛開始培養時（第0小時）的細胞數，將其訂為1。
- 檢測套組內的刃天青（resazurin）是一種氧化還原指示劑，其為無毒、可穿透細胞膜且低螢光性之深藍色染料。
- 幹細胞培養液包含Keratinocyte SFM 溶液（Gibco）、bovine pituitary extract（BPE，Gibco）、重量百分濃度10%之胎牛血清（HyClone）。
- 根據本發明一實施例，細胞培養組合物可促進細胞生長，提高細胞增生率。
- 使用不含粒線體的培養液，將各細胞培養至其體積為培養皿的八分滿時，移除培養皿中的培養液並使用磷酸鹽緩衝液（phosphate buffered saline，PBS）潤洗細胞。
細胞培養組合物中，每一毫升之細胞培養組合物可包含1微克至100微克的粒線體，但不以此為限。 在其他實施例中，每一毫升之細胞培養組合物可包含5微克至80微克的粒線體。 在其他實施例中，每一毫升之細胞培養組合物可包含15微克至40微克的粒線體。 首先，將血液抽取至含有抗凝血劑的採血管或離心管中，採血管為例如CPT管（BD 腎臟細胞 Vacutainer® CPTTMCell Preparation Tube，REF362761）。
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根據上述實驗結果，由對照組可知，在細胞培養基中添加血小板可提高細胞增生率，且增生率隨著血小板的數量增加而提升。 腎臟細胞2025 由實施例8-1至8-3可知，使用含有粒線體的細胞培養組合物來培養細胞，可使細胞具有提高的增生率，且增生率隨著粒線體的濃度增加而提升，表示含有粒線體的細胞培養組合物確實有助於細胞的生長。 由對照組8-1、實施例8-3及實施例8-4可知，使用含有粒線體及血小板的細胞培養組合物來培養細胞，可進一步提升細胞的增生率。
腎臟細胞: TW202200781A – 細胞培養組合物及其用途
較佳地，該聚氨酯是使聚醚多元醇與脂肪族多 異氰酸酯反應，接著與鏈延長劑反應而得。 更佳地，該脂肪族多異氰酸酯是選自於異佛酮二異氰酸酯、1,6-己二異氰酸酯或其組合。 該鏈延長劑是選自於1,4-丁二醇(1,4-BD)、乙二醇或其組合。 該承載柱6設置在該彈性膜2底部，並透過該孔道4與該支撐結構3間隔設置，且該彈性膜2是部分貼附於該承載柱6，以控制該貼附的部分在抽氣時受到水平方向的應力。 따라서 抗酸化機能을 腎臟細胞 가진 藥物들은 水銀에 의한 急性腎不全을 防止한다고 하였다.
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圖8顯示使用僅含血小板之對照組之細胞培養組合物培養CCD-996SK的細胞增生率，培養時間為24小時及48小時。 腎臟細胞 圖9顯示使用僅含粒線體之實施例之細胞培養組合物培養CCD-996SK的細胞增生率，培養時間為24小時及48小時。 圖10顯示使用含粒線體及血小板之實施例之細胞培養組合物培養CCD-996SK的細胞增生率，培養時間為24小時及48小時。 圖11顯示使用含粒線體及補體C3之實施例之細胞培養組合物培養ARPE-19的細胞增生率，培養時間為24小時及48小時。 初始對照組為細胞剛開始培養時（第0小時）的細胞數，將其訂為1。 圖8至圖10中，#表示相較於控制組具有顯著差異（P＜0.05），##表示相較於控制組具有高顯著差異（P＜0.01），###表示相較於控制組具有非常顯著差異（P＜0.001）。
腎臟細胞: TWM517199U – 細胞承載裝置及細胞培養系統
本發明一實施例所使用之粒線體取自人類脂肪幹細胞（adipose-derived stem cell，ADSC）。 幹細胞培養液包含Keratinocyte SFM 溶液（Gibco）、bovine pituitary extract（BPE，Gibco）、重量百分濃度10%之胎牛血清（HyClone）。 首先，在培養皿中將人類脂肪幹細胞培養至細胞數為1.5×108個細胞，再以杜氏磷酸鹽緩衝液（DPBS）沖洗培養皿中的人類脂肪幹細胞。 腎臟細胞2025 接著，移除培養皿中的杜氏磷酸鹽緩衝液後，在培養皿中加入細胞剝離用之胰蛋白酶（Trypsin），並在37℃下反應3分鐘後，再加入幹細胞培養液以終止反應。 接著，將人類脂肪幹細胞自培養皿中沖洗下來後打散，以600 g離心10分鐘後，移除上清液。
腎臟細胞: TW202200781A – 細胞培養組合物及其用途
根據本發明一實施例，藉由在細胞培養基中添加粒線體，可幫助細胞生長、提高細胞的增生率。 對於受損或老化的細胞而言，根據本發明一實施例亦能改善受損或老化的細胞的生長、降低老化細胞比例。 除此之外，根據本發明一實施例還能改善受損或老化的細胞的功能。 在學術方面，本發明確保細胞的生長效率及穩定性有助於進行後續的研究或實驗，以奠定科學發展、生物學研究的基礎。 在產業方面，本發明確保細胞的生長效率及穩定性有助於穩定產率及良率，可降低細胞培養成本並控管產品品質，以達成利益最大化。 本實驗之細胞培養流程請參考實驗一，進行細胞計數時，將ARPE-19以每孔2×104個細胞的密度於實施例之細胞培養組合物中培養24或48小時。
腎臟細胞: TWM517199U – 細胞承載裝置及細胞培養系統
如請求項1所述之細胞培養組合物，更包含補體C3，其中每一毫升的該細胞培養組合物包含0.1微克至20微克的補體C3。 如請求項1所述之細胞培養組合物，更包含血小板，其中每一毫升的該細胞培養組合物包含1×106至1×108個血小板。 在細胞培養組合物中，每一毫升之細胞培養組合物可包含0.1微克至20微克的補體C3，但不以此為限。 在其他實施例中，每一毫升之細胞培養組合物可包含10微克的補體C3 。
腎臟細胞: TWM517199U – 細胞承載裝置及細胞培養系統
本發明一實施例提供一種細胞培養組合物在改善受損或老化的幹細胞的功能的用途，其中該細胞培養組合物包含一培養基以及粒線體。 在本實驗中，進一步在細胞培養組合物中添加補體C3（Sigma-Aldrich，204885），以包含補體C3的細胞培養組合物作為培養液來培養ARPE-19。 腎臟細胞2025 參閱圖3與圖4，本新型細胞承載裝置1之第二實施例包含一彈性膜2、一支撐結構3、一孔道4及一承載柱6。