如在本申请中所用的，表述“表达盒”指包含编码cDNA或基因的核苷酸序列，以及控制和/或调节所述 cDNA或基因的表达的核苷酸序列的DNA载体或其部分。 副甲状腺癌2025 相似的或不同的表达盒可被插入一个载体或数个不同的载体中。 在本发明优选的实施方式中，所述溶瘤性腺病毒载体包含至少一个表达盒。
- 载体的有效剂量至少取决于需要治疗的受试者、肿瘤类型、肿瘤的位置和肿瘤的阶段。
- 为了有效地分离纯化或分泌目标蛋白，常常还可利用便于分离纯化的标签蛋白或标签多肽。
- 为此，本发明一方面公开了，一种肿瘤靶向多肽，其包含氨基酸序列为YXGXR所示的第一序列和氨基酸序列为YXGXR所示的另一第二序列，所述第一序列与所述第二序列之间通过连接肽链接，其中Y表示酪氨酸或其衍生物；G表示甘氨酸或其衍生物；R表示精氨酸或其衍生物；X表示含侧链带脂肪类基团或/和羟基类基团或它们组合或其衍生物的氨基酸。
- 血清型被分为6个亚组A-F并且不同的血清型已知与不同的病况（即呼吸系统疾病、结膜炎和肠胃炎）相关。
- 例如，组合疗法中的各试剂可单独地在肿瘤组织中起作用，腺病毒载体可使细胞对化学疗法或放射疗法敏感和/或化疗剂可提高病毒复制的水平或影响靶细胞的受体状态。
治疗可肿瘤内地、腔内地、静脉内地及以这些的组合被给予。 所述方法也可以清除被提出是发起肿瘤的细胞（“癌症干细胞”）。 对最优的病毒载体的要求包括找到特定靶细胞并在靶细胞中表达病毒基因组的有效能力。 副甲状腺癌2025 副甲状腺癌 此外，最优的载体必须在靶组织或细胞中保持是有活性的。 在过去的几十年中已经开发了病毒载体的所有这些特性并且在生物医学中广泛地研究了例如逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒载体。 如权利要求12所述的缀合物，其特征在于所述治疗成分包含放射性治疗成分，化学治疗成分，抗体，酶，或它们的组合。
副甲状腺癌: 副甲状腺癌の原因
含有一或多种限制性位点的合成接头提供了另一种连接DNA区段与载体的方法。 用噬菌体T4DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I处理通过内切核酸酶限制性消化产生的DNA区段，所述的两种聚合酶用其3′,5’-核酸外切活性除去突出的γ-单链末端，并用其聚合活性补平3’-凹端。 然后在能催化平端DNA分子连接的酶，如噬菌体T4DNA连接酶的存在下将平端区段与大摩尔过量的接头分子一起保温。 然后用适当的限制性酶裂解这些DNA区段，并连接至已用酶裂解的表达载体中，所述酶能产生与所述DNA区段相容的末端。 从多个商家可以买到含有多个限制性内切核酸酶位点的合成接头。
除了本发明的载体之外，药物组合物还可包含任何其它的载体（例如其它的腺病毒载体）、其它治疗上有效的试剂、任何其它的试剂，例如药学上可接受的载体、缓冲剂、赋形剂、佐剂、杀菌剂、填料、稳定剂或增稠剂、和/或任何通常在相应产品中被发现的化合物。 图8d显示了通过Ad5-DM-GMCSF诱导肿瘤特异性免疫应答，用Ad5-DM_GMCSF治愈HapTl肿瘤没有保护叙利亚仓鼠免患Hak肿瘤。 用不同的肿瘤再攻击之前用Ad5DM或 Ad5D24-GMCSF治疗过的具有HapTl肿瘤的动物（图8a)，并且随时间测量肿瘤的生长。 图6a显示了腺病毒相伴的（coupled)人GMCSF的表达。用AdOTM或Ad5D24_GMCSF 感染A549细胞系，随时间收集培养基并且通过FACSAR-RAY就GMCSF的表达进行分析。 本申请描述了重组病毒载体的构建，与所述载体相关的方法和它们在肿瘤细胞系、动物模型及癌症患者中的用途。
副甲状腺癌: 患者様へ病気と治療
血清型被分为6个亚组A-F并且不同的血清型已知与不同的病况（即呼吸系统疾病、结膜炎和肠胃炎）相关。 已知腺病毒血清型5引起呼吸系统疾病并且其是基因疗法领域中所研究的最常见的血清型。 在最初的Ad5载体中，缺失了 El和/或E 副甲状腺癌2025 3区而使得能够将外源DNA插入载体中（Danthirme 和Imperiale 2000)。此外，缺失其它区域以及另外的突变为病毒载体提供了另外的特性。 的确，已经建议了对腺病毒的各种修饰用于实现有效的抗肿瘤效果。
从保藏菌株的固体LB培养基平板上挑取一个转化有EGFP-TAT-pET28a质粒的单菌落于30ml含有卡那霉素(10-50mg/L)的LB液体培养基中在37℃振荡培养至OD600约为0.5-1.0。 ①EGFP-ELBD-H2-pET28a质粒构建方案如实施例1中所述。 副甲状腺癌2025 随后从保藏菌株的固体LB培养基平板上挑取一个转化有EGFP-ELBD-H2-pET28a质粒的单菌落于30ml含有卡那霉素(10-50mg/L)的LB液体培养基中在37℃振荡培养至OD600约为0.5-1.0。 ①EGFP-Tn-HBD-pET28a质粒构建方案如实施例1中所述。
副甲状腺癌: 副甲状腺腫瘍の
序列V16-9，V16-3，V16-2， 和V16-1的穿膜效果都低于ELBD。 与V16-3，V16-2相比，V16-1的效果更差，其与V16-9相当。 这说明这三个Cys对突变体的三级结构有重大影响，都可能参与了这个结构域空间结构的成环过程，从而对穿膜效率产生一定的影响。
副甲状腺癌: 副甲状腺癌の再発
24.根据权利要求19-23中任一项的用途或方法，其中在治疗期间施用溶瘤性腺病毒载体或药物组合物数次。 20.治疗受试者中的癌症的方法，其中所述方法包括向受试者施用根据权利要求1-15 副甲状腺癌2025 或17中任一项的载体或药物组合物。 19.根据权利要求1-15中任一项的腺病毒载体在制备药物中的用途，其中所述药物用于治疗受试者中的癌症。 在本发明的优选实施方式中，所述方法或用途还包括向受试者施用维拉帕米或另一种钙通道阻断剂。
副甲状腺癌: 副甲状腺癌の診断
本发明的目的是提供用于实现腺病毒的上述特性的新的方法和手段，并从而解决常规癌症疗法的问题。 权利要求30所述的药物组合物，其特征在于其还包含放射性治疗成分，放射性核素，毒素，治疗成分，化学治疗成分，或它们的组合。 如权利要求18所述的缀合物，其特征在于所述放射性治疗成分包含放射性同位素，所示放射性同位素为碘-131，镥-177，钇-90，钐-153，磷-32，铯-131，钯-103，镭-223，碘-125，硼-10，锕-225，铋-213，镭-225，铅-212，钍-232，或它们的组合。
副甲状腺癌: 副甲状腺がん
29.根据权利要求19-28中任一项的用途或方法，其中所述方法还包括向受试者施用诱导自我吞噬的试剂。 28.根据权利要求19-27中任一项的用途或方法，其中所述方法还包括向受试者施用维拉帕米或另一种钙通道阻断剂。 7.根据前述权利要求中任一项的溶瘤性腺病毒载体，其中编码GM-CSF的核酸序列在病毒E 3启动子的控制之下。 除了客观地测量抗肿瘤活性之外，我们还在数例中见到了临床的和/或主观的益处（表9)。这些包括患者的整体健康改善了，明显感到肿瘤更柔软了和/或更小了以及由肿瘤引起的症状得到了缓解。重要的是，两名之前遭受腹水和/或胸腔积液快速积聚的患者，在病毒治疗后具有所述积聚的清楚的减少，此效果在两例中均持续了数月。
副甲状腺癌: 患者さんの手記
本发明的载体还可以包含除上述CR2和E3的部分缺失及GM-CSF序列的插入之外的其它修饰。 在本发明的优选实施方式中，Ad 5载体的所有其它区域都是野生型的。 在本发明的优选实施方式中，野生型区域位于El区的上游。 在本发明的优选实施方式中，编码GM-CSF的核酸序列是野生型的。 如本申请中所用的，表述“腺病毒血清型5仏肪）核酸骨架”指Ad5的基因组或部分基因组，其包含选自下列的一个或数个区域：Ad5起源的部分El、pIX、pIVa2、E2、VA1、VA2、 L1、L2、L 副甲状腺癌2025 3、L4、部分E3、L5和E4。
副甲状腺癌: 副甲状腺がんはどんな病気ですか
图fe显示了 Ad5-DM_GMCSF在带有胰腺癌肿瘤的叙利亚仓鼠（允许人腺病毒复制）中的体内效力。 Ad5DM和Ad5-DM-GMCSF均在治疗后的16天内清除肿瘤。 图6b显示了腺病毒表达的GMCSF在人淋巴细胞中保持其生物学活性。 在存在人重组GMCSF(大肠杆菌生产的，购自Sigma)或存在来自经Ad5-DM_GMCSF感染的细胞的上清液时培养需要人GMCSF而存活的TFl细胞。
副甲状腺癌: 甲状腺がん 患者数（がん統計）
本发明还涉及所述载体在制备用于治疗受试者中的癌症的药物中的用途，以及治疗受试者中的癌症的方法。 此外， 本发明涉及在细胞中产生GM-CSF和在受试者中增加肿瘤特异性免疫应答的方法，以及涉及本发明的溶瘤性腺病毒载体用于在细胞中产生GM-CSF和在受试者中增加肿瘤特异性免疫应答的用途。 此外，本发明涉及在细胞中产生GM-CSF和在受试者中增加肿瘤特异性免疫应答的方法，以及涉及本发明的溶瘤性腺病毒载体用于在细胞中产生GM-CSF和在受试者中增加肿瘤特异性免疫应答的用途。 作为表达GM-CSF的结果，细胞毒性T细胞和/或天然杀伤细胞被刺激、产生和靶向。 在本发明的优选实施方式中，天然杀伤细胞和/或细胞毒性T细胞的量在靶细胞或组织中增加。 副甲状腺癌2025 副甲状腺癌2025 为了追踪或研究本发明的效果，可测定各种免疫应答的标志物（例如，发炎的标志物）。
副甲状腺癌: 分子標的薬治療
这将转基因的表达限制在允许病毒复制和随后活化E 3启动子的肿瘤细胞中。 副甲状腺癌2025 E 3启动子可以是任何本领域已知的外源或内源启动子，优选是内源启动子。 在本发明的优选实施方式中，编码GM-CSF的核酸序列在病毒E 3启动子的控制下。 诱导针对允许未装备的病毒复制的细胞的免疫反应通常强度不足以引起发展治疗性肿瘤免疫性。 为了克服这一弱点，本发明提供了具有抗肿瘤免疫性的强效诱导因子的经装备的病毒。
副甲状腺癌: WO2018165867A1 – 肿瘤靶向多肽、制备方法及其应用
同时也可以通过替换个别易酶解的氨基酸残基，或者是将L-型氨基酸替换为D-型氨基酸来延长或改善多肽药物的半衰期。 本发明的基因疗法单独是有效的，但是腺病毒基因疗法与任何其它疗法（例如传统的疗法）的组合可以比单独的任何一个更有效。 例如，组合疗法中的各试剂可单独地在肿瘤组织中起作用，腺病毒载体可使细胞对化学疗法或放射疗法敏感和/或化疗剂可提高病毒复制的水平或影响靶细胞的受体状态。 仅施用一次本发明的溶瘤性腺病毒载体便可具有治疗效果。
副甲状腺癌: 副甲状腺がんの治療(PDQ®)
单独的病毒复制虽然是免疫原性的，但是通常不足以诱导有效的抗肿瘤免疫性。 为了强化对治疗性免疫性的诱导，可用激发性蛋白（例如细胞因子）装备病毒，用于促进将肿瘤抗原引入抗原呈递细胞（例如树突细胞），以及用于它们的激发和/或成熟。 将免疫治疗性基因引入肿瘤细胞中以及蛋白质的翻译，导致免疫应答的活化和有效地破坏肿瘤细胞。 在这方面最相关的免疫细胞是天然杀伤细胞（NK)和细胞毒性⑶8+T细胞。 本发明所要解决的技术问题为提供一种能够高效专一性识别和具有更强结合力的多肽结构，其能与肿瘤细胞表面大量过表达存在的表皮生长因子受体专一性结合，从而可被用于肿瘤细胞的标记性识别诊断，或竞争性与EGFR结合，或携带肿瘤治疗药物分子达到肿瘤细胞表面，发挥靶向性治疗作用。 表达盒被用于通过利用载体而在靶标（例如细胞）中表达转基因。
如在本申请中所使用的，衣壳的“Ad5/3嵌合体”指嵌合体，其中纤毛的节部分来自 Ad血清型3而纤毛的其余部分来自Ad血清型5。 副甲状腺癌2025 如在本申请中所使用的，表述“病毒包装信号“指病毒DNA的一部分，其由一系列富含AT的序列组成并且控制衣壳化过程。 如本申请中所使用的，表述〃 VAl 〃和〃 VA2″指与RNAl和RNA2相关的病毒，所述RNA被腺病毒转录但是不被翻译。VAl和VA2在对抗细胞防御机制中起作用。
副甲状腺癌: 副甲状腺機能亢進症顎腫瘍症候群（Hyperparathyroidism-jaw tumor syndrome：HPT-JT症候群）
随后从保藏菌株的固体LB培养基平板上挑取一个转化有MAP30-ELBD-H2-pET28b质粒的单菌落于30ml含有卡那霉素(10-50mg/L)的LB液体培养基中在37℃振荡培养至OD600约为0.5-1.0。 ①TCS-ELBD-H2-pET28b质粒构建方案如实施例1中所述。 从保藏菌株的固体LB培养基平板上挑取一个转化有TCS-ELBD-H2-pET28b质粒的单菌落于30ml含有卡那霉素(10-50mg/L)的LB液体培养基中在37℃振荡培养至OD600约为0.5-1.0。
副甲状腺癌: 副甲状腺癌
除了使得载体能够转运到目的位点，本发明的载体也确保了转基因的表达和持续。 如权利要求21所述的缀合物，其特征在于所述放射性诊断成分包含氟-18，锝-99，钼-99，铷-82，锶-82，铊-201，或它们的组合物。 如权利要求12所述的缀合物，其特征在于所述诊断成分包含放射性诊断成分，荧光成分，量子点，或它们的组合物。 将TCS的基因序列与ELBD突变体核苷酸序列以及H2穿膜肽序列融合表达后，其TCS-ELBD-H2对B16(鼠黑色素瘤细胞)的抑制率显著提高(图7)。 选用11种细胞来研究EGFP-ELBD-HBD重组蛋白的肿瘤靶向性特征。 其中包括9种人体肿瘤细胞：HeLa(人宫颈癌细胞)、Bcap(人乳腺癌细胞)、A549(人肺癌细胞)，A357(人恶性黑素瘤)，T24(人膀胱癌细胞)，MGC-803(人胃癌细胞)，95D(人巨细胞肺癌细胞)，BxPC-3(人胰腺癌细胞)，5637(人膀胱癌细胞)，以及2种正常人体细胞：MRC-5(人胚肺成纤维细胞)，293T(人肾上皮细胞)。
这一环状结构中的Tyr、Gly、Arg以及C端的Leu为高度保守，这些保守氨基酸任何缺失或C端的包括Leu在的大段缺失突变，都可以导致受体结合活性的丧失。 EGF类配体分子与EGFR结合后，能使表皮生长因子受体相互之间形成同源二聚体或异源二聚体，导致胞内酪氨酸激酶区的激活，彼此可将对方酪氨酸残基磷酸化，启动一系列级联反应，将信号传到细胞核内，最终引起一系列相关基因活化，导致肿瘤细胞增殖、凋亡抑制，促使肿瘤细胞转移并导致放、化疗耐受，在肿瘤发生发展过程中起重要作用。 这种能在体内外与肿瘤细胞特异性识别结合的多肽被简称为肿瘤靶向肽。 35.增加受试者中肿瘤特异性免疫应答的方法，其中所述方法包括：a)将包含根据权利要求1-15中任一项的的溶瘤性腺病毒载体的媒介运送至靶细胞或组织，b)在所述细胞中表达所述载体的GM-CSFJPc)在所述靶细胞或组织中增加细胞毒性T细胞和/或天然杀伤细胞的量。 在所述Ad5-DM-GM_CSF治疗之前或之后接受了不间断的施用环磷酰胺的患者中利用了此方法，并在从这些患者中收获的PBMC上进行了 T reg分析。 在图12中所示的实例中，显示了来自患者R73的一个实例，其显示循环T reg的减少。