為了評估體內之腫瘤血管形成潛能，轉染GFP至C1細胞 株(C1-GFP細胞株)，並將其經皮下移植至重症聯合免疫缺陷小鼠體內以形成腫瘤。 利用免疫螢光染色，偵測到C1-GFP細胞株衍生腫瘤中的內皮細胞抗原，包含CD31、vWF與CD105。 有些血管不完全表現內皮細胞抗原，且GFP陽性細胞(GFP+cell)直接融合至血管中，展現似馬賽克的結構。 此外，有些內皮細胞同時表現內皮細胞抗原且為GFP陽性(圖17-i,ii與iii)。
有鑑於口腔癌的預防，診斷及治療，有其未滿足的醫療需求，據此，本發明遂提出一種喹唑啉酮衍生物作為製備口腔癌藥物之用途，以解決習知技術所造成之問題。 本發明提供一實施例，其內容在於喹唑啉酮衍生物作為製備口腔癌藥物之用途，其中該喹唑啉酮衍生物係進一步搭配一5-氟尿嘧啶。 喹唑啉酮衍生物作為製備口腔癌藥物之用途 本發明係有關一種喹唑啉酮衍生物，尤其是一種喹唑啉酮衍生物作為製備口腔癌藥物之用途。 軟瓊脂細胞群落形成能力試驗係透過接種3×103顆細胞於35mm之組織培養盤，其包含一層0.35%低熔融瓊脂/ES/MCDB-201覆蓋於一層0.5%低熔融瓊脂/ES/MCDB-201之上。 每隔兩天外加完整培養液，兩週後細胞群落以0.05%結晶紫和甲醇固定，拍攝細胞群落生成並以光學顯微鏡定量。 過量表現Oct-4之CAR+/mPSC代表於CAR+/mPSC中Oct-4之表現量高於正常細胞10倍。
腫瘤形成: 正常の好酸球数
C1、E9與C7細胞株在內皮細胞生長培養基培養7天以檢查管柱形成能力，亦培養CAR+/mPSCs作為控制組。 以內皮細胞生長培養基培養之C1、E9與C7細胞株展現管柱形成能力，然而以內皮細胞生長培養基培養之CAR+/mPSCs並無法觀察到此能力(圖15與)。 在內皮細胞生長培養基中，C1、E9與C7細胞株表現內皮細胞標記，包括CD31、CD105、CD34與CD144(圖16)。 腫瘤形成2025 這些結果指出CAR+/mPSCsOct-4_hi不僅擁有血管新生潛能，亦參與體外之管柱形成。
- 端粒酶活性係利用端粒酶重複擴增(telomerase repeat amplification；TRAP)試驗測量，細胞於TRAP裂解緩衝液中均質化。
- 而，5mg/kg的組別則在第12天(第6次加藥)就可觀察到腫瘤大小與沒加藥組別相比已有明顯變小，並在第50天結束觀察時比起沒有加藥的組別小了約41.7%。
- 即時聚合酶連鎖反應(real-time PCR)係利用7900HT即時聚合酶連鎖反應儀器操作，引子序列列於表1中，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase；GAPDH)表現用於標準化。
- 本發明亦關於一種具有腫瘤的老鼠用於抗癌藥物篩選的用途，其中該腫瘤係由癌起始細胞所誘導，其中該癌起始細胞包含過量表現Oct-4之分離的克沙奇病毒及腺病毒受體陽性之老鼠肺部幹細胞/先驅細胞。
- 免疫組織化學染色係將此腫瘤切片與相對應之HRP-偶聯之二級抗體在室溫下反應一小時後，利用0.05%之3,3′-二氨基聯苯胺(3,3’-diaminobenzidine；DAB)以肉眼觀察，細胞核以蘇木精複染。
另外，C1、E9與C7細胞株能繁殖超過50代，其倍增時間為23±1小時(圖6)，在表5中顯示倍增時間。 有數個增生階段其細胞逐漸累積並開始發展異常外觀，是為發育異常階段的出現。 口腔癌症狀主要為口腔內潰瘍、硬塊、紅斑、白斑或伴有頸部淋巴腫大、不能張口、咀嚼吞食困難等，初期大都沒有疼痛，當腫瘤變大，局部壞死後可能造成細菌感染以致疼痛異常。
腫瘤形成: 正常の好酸球数
本發明提供一實施例，其內容在於喹唑啉酮衍生物作為製備口腔癌藥物之用途，其中該口腔癌細胞係一口腔鱗狀上皮癌細胞。 為了達到上述之目的，本發明揭示了一種喹唑啉酮衍生物作為製備口腔癌藥物之用途，其中該喹唑啉酮衍生物係用於抑制一口腔癌細胞，該喹唑啉酮衍生物具有如下結構式： 腫瘤形成2025 。 本發明係有關一種喹唑啉酮衍生物作為製備口腔癌藥物之用途，喹唑啉酮衍生物係藉由苯基喹(phenylquinazolines，PQZ) 衍生物進一步加上嗎啉基與苯環(帶 F支鏈)形成。 又，喹唑啉酮衍生物其係用於抑制口腔癌細胞之存活，並促進口腔癌細胞之凋亡。 腫瘤形成 是以，本發明進一步比較CAR+/mPSCs、CAR+/mPSCsOct-4_hi與A549細胞株(人類肺腺癌細胞株)之差別(表3)。
- 該化療抗性意指CAR+/mPSCOct-4_hi對於化學放射治療或化療藥具有抗性。
- 在一較佳具體實施例中，該Oct-4基因之序列為SEQ ID NO：1。
- 而口腔癌則為上述區域發生異常的增生，侵犯至周邊正常的組織，甚至轉移至身體其它部位，影響正常功能的運作進而危及生命。
- 細胞以別藻藍蛋白(allophycocyanin；APC)共軛抗老鼠CD133抗體標記，接著以螢光流式細胞分選測量儀分析。
- 腫瘤切片於檸檬酸鹽緩衝液(10mM，pH 6.0)中經微波輻射修復抗原，將此腫瘤切片與初級抗體於4℃下反應過夜。
- 在一較佳具體實施例中，該表現量係指蛋白質的表現量，該蛋白質是由一Oct-4的基因編碼而得。
- 腫瘤尺寸每3天以卡尺測量一次，且體積根據下列標準算式計算：長度×寬度2/2。
為了確定GFP陽性之內皮細胞的出現，分離腫瘤並以流式細胞儀檢測，其結果與免疫螢光染色相似，12-18%之CD31+族群亦為GFP陽性(圖17)。 為了檢查CAR+/mPSCsOct-4_hi細胞株與內皮細胞之間的關聯，利用即時聚合酶連鎖反應(real-time PCR)分析血管新生相關受體血管內皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 腫瘤形成2025 2；VEGF2)與Tie2之基因表現。 腫瘤形成2025 專一性表現在內皮細胞之受體Tie2在內皮細胞生長培養基培養之C1、E9與C7細胞株中其表現皆顯著高於CAR+/mPSCs；而血管內皮生長因子受體2並無顯著差別(圖18)。
腫瘤形成: 正常の好酸球数
在另一具體實施例中，該CAR+/mPSCOct-4_hi表現內皮細胞之表面標記，其中該內皮細胞之表面標記包含CD31、CD105、CD34、CD144或其組合。 針對肺部癌起始細胞，已有不同的生物標識被提出，包含CD133的表現、乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase；ALDH)活性及化療 抗性。 在一具體實施例中，CAR+/mPSCOct-4_hi表現CD133、乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase；ALDH)活性、化療抗性及其組合。 該化療抗性意指CAR+/mPSCOct-4_hi對於化學放射治療或化療藥具有抗性。 在一具體實施例中，該CAR+/mPSCOct-4_hi為一肺癌起始細胞。 過量表現Oct-4之CAR+/mPSC代表在CAR+/mPSC中的Oct-4表現量高於正常細胞10倍。
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因此，應了解到雖然已根據較佳實施例及任意的特點來具體揭示本發明，但是熟知此技藝者仍會修改和改變其中所揭示的內容，諸如此類的修改和變化仍在本發明之申請專利範圍內。 一個熟知此領域技藝者能很快體會到本發明可很容易達成目標，並獲得所提到之結果及優點，以及那些存在於其中的東西。 本發明中之方法乃較佳實施例的代表，其為示範性且不僅侷限於本發明領域。 蛋白質生存素已被充分證實能夠抑制細胞凋亡並在賦予癌起始細胞化療抗性中扮演重要的角色。 本發明發現生存素表現量在C1、E9與C7細胞株中明顯較CAR+/mPSCs高(圖11)。
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細胞之乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase；ALDH)活性係利用ALDEFLUOR試驗套組偵測，其根據製造商之說明操作。 將細胞懸浮於含有BODIPY-氨基乙醛(BODIPY-aminoacetaldehyde；BAAA)的ALDEFLUOR試驗緩衝劑於37℃下反應60分鐘。 細胞以一種乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase；ALDH)抑制劑(二乙基氨基苯甲酮(diethylaminobenzaldehyde；DEAB))處理並作為陰性對照組。 螢光流式細胞分選測量儀藉由綠色螢光通道( nm)用於分析細胞之乙醛脫氫脢活性。 圖16顯示以內皮細胞生長培養基培養之CAR+/mPSCsOct-4_hi表現內皮細胞的表面標記，CAR+/mPSCsOct-4_hi C1、E9、C7細胞株於內皮細胞生長培養基中培育7天，接著分析其內皮細胞專一性表面標記之表現，其包括CD31、CD105、CD34及CD144，數字表示陽性表現族群。 在一具體實施例中，本發明進一步包含一步驟後的步驟，是為步驟，其為測試候選藥物對於癌起始細胞之細胞毒 性。
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本文中所使用之「一」可指一個或多個，本文之申請專利範圍中與「包含」字詞之連接使用時，「一」可指一個或一個以上。 請參閱第1圖，其係本發明之喹唑啉酮衍生物之化學結構圖，並如第1圖所示，本發明之一喹唑啉酮衍生物(代稱為HoLu)係由苯基喹(phenylquinazolines，PQZ)衍生物進一步加上嗎啉基與苯環(帶F支鏈)形成。 腫瘤形成2025 因此，在臨床上常可見到黏膜表面產生變異或不當增生，形成白斑、紅斑、紅白斑、潰瘍、疣狀上皮增生或是口腔黏膜纖維化，以上皆為口腔癌前期之病變可能情況，而上述病變之情況，又可因為長期發炎刺激，進而進一步演變成口腔癌。 腫瘤形成2025 腫瘤形成2025 口腔癌為當口腔黏膜長期受到危險因子的刺激，會使得基因調控失衡或突變所造成細胞變異。 而與口腔癌相關的危險因子包括：吸菸、喝酒、嚼食檳榔、紫外線照射、蛀牙、不當之假牙、不良之口腔衛生、長期的營養不良、病毒的感染等。 口腔部位可分為唇、夾黏膜(唇及臉頰的內襯)、牙齒、舌頭下方的口腔底部、前三分之二的舌頭、口腔頂部的前面部分(硬顎)、牙齦及臼齒後方的小區域。
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此具有附加的優點，即腫瘤的目視檢查允許藥物療效之立即性及持續性的評估。 在非可見腫瘤的情況下，藥物效果評估通常需要藉由犧牲動物來檢查腫瘤。 腫瘤可根據技術人員的標準技術偵測，其方法包括，除了肉眼檢查外(用於皮膚損傷)，組織化學及免疫組織化學技術等。 通常，候選藥物係根據其抑制移植細胞株所發展之腫瘤形成和/或生長能力進行評估。 此發明更進一步包含 確定該候選藥物是否為抗癌藥，其乃根據步驟之候選藥物效能評估結果。
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在一較佳具體實施例中，該Oct-4基因序列為SEQ ID NO：1。 在一具體實施例中，該CAR+/mPSCOct-4_hi具有血管新生的功能。 在一較佳具體實施例中，該CAR+/mPSCOct-4_hi具有參與血管形成的功能。 因此，該CAR+/mPSCOct-4_hi不僅具有血管新生潛能，亦參與腫瘤血管形成。 在另一具體實施例中，該CAR+/mPSCOct-t_hi具有活化ANG/Tie2訊息途徑而加強血管新生的功能。 在一較佳實施例中，CAR+/mPSCOct-4_hi擁有活化Tie2訊息途徑而加強血管新生的功能。