使用Cox比例危險回歸分析來評估MSI-M與其他臨床病理因素之間之相關性以用於預測復發性遠端轉移。 MSI-M在轉移性第II期/第III期原發性CRC中之頻率顯著高於MSI-M在非轉移性第II期/第III期原發性CRC中或在第IV期原發性CRC中之頻率。 SMARCA2R-LOH在異時LM中之頻率顯著高於異時LM所源自之轉移性第II期/第III期原發性CRC中的頻率，表明SMARCA2R-LOH可促進散播後之轉移過程。
- 純化基因、核酸、蛋白質及其類似物用於指經鑑別且與至少一種通常締合之污染核酸或蛋白質分離之彼等實體。
- 本發明進一步係關於一種用於在經診斷患有原發性大腸直腸癌之患者中預測癌症療法成功機率或兩者之方法，該方法包含：鑑別經診斷患有原發性CRC之患者；及確定獲自患者之一或多個生物樣本之細胞中一或多個單核苷酸、二核苷酸、四核苷酸重複處或其任何組合之微衛星不穩定性程度，其中在個體樣本之大部分細胞中存在MSI-M表型表示高復發風險、高遠端轉移(包括肝轉移)風險、降低之癌症療法成功可能性或其任何組合。
- 如請求項17之套組，其中在來自該個體之該樣本中之大部分細胞中存在MSI-M表型或該MSI-M與SMARCA2R-LOH表型表示在該人類個體中存在高復發風險及降低之無復發存活機率。
- 在MSI-M陽性LM中展現高頻率LOH或MSI之基因座中，9p24.3上之SMARCA2R-LOH在LM及第IV期原發性CRC組織中與MSI-M相關，而在第II期及第III期原發性CRC組織中與此無關。
- 如請求項9之方法，其中該方法係用於治療患有大腸直腸癌之患者；選擇用於患有大腸直腸癌之患者之抗贅生劑療法；將患者分階層於大腸直腸癌子組中或用於大腸直腸癌療法臨床試驗；確定對大腸直腸癌治療方案之抗性或反應性；開發用於診斷大腸直腸癌之套組；或其任何組合。
- 該等結果可與上文之發現(即MSI-M為關於第II期/第III期原發性CRC之復發性遠端轉移的獨立預測因子)相容。
- 23吾人選擇45種在5’UTR、內含子或3’UTR中具有8個或8個以上單元(8至49個單元)之含有多形態CA/GT之基因(表5.1、5.2及5.3)。
總而言之，本案發明人發現SMARCA2R-LOH為與MSI-M相關之重要遺傳標記且約50%之LM來自原發性CRC。 MSI分析：為確定原發性CRC及LM組織之MSI狀態，使用經螢光標記之引子自染色體組DNA執行PCR擴增。 熱變性之後，使經擴增PCR產物在ABI PRISM 3100 Avant遺傳分析器上電泳且由GeneMapper片段分析軟體進行分析。 當由腫瘤組織產生之PCR產物與來自匹配正常組織之產物相比展現至少一個新峰時，確定基因座呈MSI陽性。
腫瘤級別: TW201300777A – 預測大腸直腸癌轉移復發之生物標記
其中，吾人選擇64種在5′-UTR、外顯子或3′-UTR中具有8個以上三核苷酸重複單元之多形態基因。 腫瘤級別2025 腫瘤級別2025 為選擇具有二核苷 酸重複之基因，吾人使用Satellog資料庫。 23吾人選擇45種在5’UTR、內含子或3’UTR中具有8個或8個以上單元(8至49個單元)之含有多形態CA/GT之基因(表5.1、5.2及5.3)。
如請求項23之方法，其中該樣本係選自由冷凍或新鮮組織樣本、FFPE組織樣本、糞便樣本、一或多種生物流體或其任何組合組成之群。 如本文中所用之術語「或其組合」係指該術語之前所列項目之所有排列及組合。 舉例而言，「A、B、C或其組合」意欲包括以下至少一者：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，且若在特定情形下次序重要，則亦包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。 繼續此實例，明確地包括含有一或多個項目或術語的重複之組合，諸如BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等等。 熟練技術人員應理解，除非自上下文顯而易見，否則一般對任何組合中之項目或術語數目均無限制。
腫瘤級別: TW201300777A – 預測大腸直腸癌轉移復發之生物標記
在又一態樣中，第II期及第III期原發性CRC中存在MSI-M表型表示在人類個體中存在高復發性遠端轉移風險，包括肝轉移。 腫瘤級別2025 在另一態樣中，其中該方法用於治療患有大腸直腸癌之患者；選擇用於患有大腸直腸癌之患者的抗贅生劑療法；將患者分階層於大腸直腸癌子組中或用於大腸直腸癌療法臨床試驗；確定對大腸直腸癌治療方案之抗性或反應性；開發用於診斷大腸直腸癌之套組；或其任何組合。 腫瘤級別 在一態樣中，存在MSI-M與SMARCA2R-LOH兩者表示自原發性CRC發生肝轉移。
如請求項11之生物標記，其中確定該等細胞中之MSI-M表型係基於包含單核苷酸、二核苷酸及四核苷酸重複基因座標記之組。 142種基因座中之87種(61%)在大於6%的資訊性病例中展現LOH(表8)。 該等結果表明可經由與LOH相關之染色體不穩定性路徑在MSI-M陽性LM中產生大量遺傳變化，儘管該等腫瘤展現中等程度之MSI。 縮寫：大腸直腸癌、肝轉移、微衛星不穩定性、所選四核苷酸重複處升高之微衛星變化、異質性缺失、低程度之MSI(MSI-L)、高程度之MSI(MSI-H)、中等MSI(MSI-M)、SMARCA2區域處之LOH(SMARCA2R-LOH)。
腫瘤級別: TW201300777A – 預測大腸直腸癌轉移復發之生物標記
如本文所用之「生物標記」係指與特定病理學或生理學狀態相關之分子指示物。 如本文所用之「生物標記」為關於癌症之分子指示物，更特定言之為關於第II期及第III期原發性CRC之遠端轉移的指示物。 「生物標記」之實例包括(但不限於)BAT25、BAT26、D2S123、D5S346、D17S250、D18S64、D18S69、MYCL1、D20S82、D20S85、L17835、D8S321、D9S242、D19S394或其組合。 如本文所用，術語「免疫組織化學」(在應用於細胞時亦稱作「免疫細胞化學」)係指診斷病理學中之工具，其中單株抗體之組可用於未分化贅瘤之鑑別診斷中(例如，以辨別淋巴瘤、癌瘤及肉瘤)，以揭示對於某些腫瘤類型及其他疾病具特異性之標記、診斷表型惡性淋巴瘤且證明病毒抗原、癌蛋白、激素受體及增殖相關核蛋白之存在。
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如請求項1之方法，其中在第II期及第III期原發性CRC中存在該MSI-M表型表示該人類個體中存在高復發性遠端轉移風險，包括肝轉移。 圖6A至6D為LM及導致LM之原發性CRC中的MSI型態及SMARCA2R LOH。 該圖提供來自圖6A：34例同時LM，圖6B：40例異時LM，圖6C：37例第IV期原發性CRC及圖6D：64例分析MSI及SMARCA2R處之LOH的導致LM之第II期/第III期原發性CRC的詳細資料。 各欄描繪以下：關於7種EMAST標記(1至7)、5種具有CA重複之標記(a至e)、2種具有單A重複之標記(f及g)的突變資料、MSI-M狀態、SMARCA2R LOH狀態。 對於MSI-M狀態，M表示MSI-M，HS表示H-MSS且H表示MSI-H。
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在MSI-M(表2)或其他CRC種類(未展示)與臨床病理學特徵(諸如年齡、性別、腫瘤級別、位置、階段及存在抑或不存在佐劑化學療法)之間未發現顯著相關性。 患者及DNA分離：在Chonnam National University Hospital,Gwangju及Chonnam National University Hwasun Hospital,Chonnam,Republic of Korea，在至少5年之追蹤時段期間收集連續167例原發性CRC及匹配正常組織。 對所有患者提供書面知情同意書，且該研究得到機構審查委員會認可。 對於DNA提取，分別自經石蠟嵌埋之切片(10 腫瘤級別 μm)微剝離腫瘤及正常組織。 使用QIAamp DNA FFPE組織純化套組自經微剝離之組織分離及純化染色體組DNA。 如本文所用，術語「大腸直腸癌」包括廣泛接受之醫學定義，其將大腸直腸癌定義為以小腸以下之腸道(亦即，大腸(結腸)，包括盲腸、上行結腸、橫結腸、下行結腸、乙狀結腸及直腸)的細胞癌症為特徵之醫學病狀。
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另外，如本文所用，術語「大腸直腸癌」亦進一步包括以十二指腸及小腸(空腸及迴腸)的細胞癌症為特徵之醫學病狀。 如請求項17之套組，其中該等生物樣本係選自由冷凍或 新鮮組織樣本、FFPE組織樣本、生檢、糞便樣本、一或多種生物流體或其任何組合組成之群。 如請求項1之方法，其中存在該MSI-M與該SMARCA2R-LOH兩者表示自原發性CRC發生肝轉移。 根據本發明，可在無不當實驗之情形下製造及執行本文中所揭示及主張之所有組合物及/或方法。 儘管已根據較佳實施例描述本發明之組合物及方法，但熟習此項技術者將顯而易見，在不偏離本發明之概念、精神及範疇下，可對本文所述之組合物及/或方法，及該方法之步驟或步驟次序施加變化。 熟習此項技術者顯而易見之所有該等類似替代及修改均認為在如隨附申請專利範圍所定義之本發明之精神、範疇及概念內。
腫瘤級別: TW201300777A – 預測大腸直腸癌轉移復發之生物標記
由於亦已知腫瘤內低氧增強癌症侵襲性且促進原發性腫瘤組織之轉移潛能，31,32因此低氧可為經由MSH3下調誘發MSI-M且引起促進轉移之重要變化者。 為確定MSI-M與遠端轉移如何相關，鑑別與MSI-M相關及與肝轉移之能力相關之遺傳變化。 首先，選擇142種在基因內序列中含有二核苷酸、三核苷酸或四核苷酸重複之候選基因(表5.1至5.3)。 針對在24例已於上述研究中發現呈MSI-M陽性之LM中高頻率之MSI或LOH篩檢該等基因。 總而言之，該等結果表明MSI-M與導致遠端轉移(包括轉移至肝)之第II期/第III期原發性CRC顯著相關。 該等結果可與上文之發現(即MSI-M為關於第II期/第III期原發性CRC之復發性遠端轉移的獨立預測因子)相容。
腫瘤級別: TW201300777A – 預測大腸直腸癌轉移復發之生物標記
每一數值對應於EMAST且字母對應於NCI標記，如下：1：MYCL1，2：D19S394，3：D20S85，4：D20S82，5：D9S242，6：L17835，7：D8S321， 腫瘤級別2025 腫瘤級別 a：D2S123，b：D175250，c：D5S346，d：D18S64，e：D18S69，f：BAT25，g：BAT26。 當正常組織在特定標記處展現異質性時，評估相應腫瘤組織中之LOH。 比較正常細胞中兩種對偶基因之間之信號強度比率及相應腫瘤細胞中兩種對偶基因之間之信號強度比率。 當腫瘤細胞之比率展現小於正常細胞中比率之45%時，確定基因座呈LOH陽性。 術語各研究組之間之「統計學上顯著」差異係有關於使用適當統計學分析(例如χ2(Chi-square)測試、t測試)時各組相同之機率小於5%(例如，p 術語「套組」或「測試套組」表示分析所需試劑與佐劑之組合。儘管測試套組在大多數情形下由若干單元組成，但單件式分析元件亦可適用，其須同樣視為測試套組。
腫瘤級別: TW201300777A – 預測大腸直腸癌轉移復發之生物標記
如請求項1之方法，其中該等四核苷酸重複基因座標記包含MYCL1、D20S82、D20S85、L17835、D8S321、D9S242、D19S394或其任何組合。 如請求項1之方法，其中該等二核苷酸重複基因座標記包含D2S123、D5S346、D17S250、D18S64、D18S69或其任何組合。 如本說明書及申請專利範圍中所用，詞語「包含」(及包含之任何形式，諸如「包含」及「包含」)、「具有」(及具有之任何形式，諸如「具有」及「具有」)、「包括」(及包括之任何形式，諸如「包括」及「包括」)或「含有」(及含有之任何形式，諸如「含有」及「含有」)為包括性或開放性的且不排除額外、未陳述之要素或方法步驟。 如本文所用，短語「基本上由…組成」將申請專利範圍之範疇限制為特定材料或步驟及不實質上影響所主張發明之基本及新穎特徵的彼等材料或步驟。 如本文所用，短語「由…組成」排除申請專利範圍中未指定之任何要素、步驟或成分，除例如通常與要素或限制相關之雜質以外。 藉由訪問NCBIPubMed文獻資料庫(/pubmed)檢查所選基因與「癌症」之相關性。
腫瘤級別: TW201300777A – 預測大腸直腸癌轉移復發之生物標記
本發明係關於基於在大腸直腸癌組織中存在微衛 星變化(在所選四核苷酸重複處之所選升高的微衛星變化)及/或在單核苷酸與二核苷酸重複基因座(MSI-L)表型處存在低程度之微衛星不穩定性或在9p24.3上之SMARCA2區處存在異質性缺失，用於預測第II期及第III期原發性CRC之遠端轉移復發的標記及用於鑑別處於轉移復發的高風險下之患者之方法。 儘管可使用不同標記來鑑別具有缺陷型MMR之CRC，使用僅具有單核苷酸重複之標記的分析明確定義且以高準確度偵測此類型之CRC。 腫瘤級別2025 3,4當使用具有單核苷酸或二核苷酸重複之標記(諸如NCI參考標記)時，連同MSI-H及微衛星穩定CRC一起偵測到在二核苷酸重複處具有低MSI(MSI-L)之CRC。 2大多數MSI-H偶發性CRC已藉由啟動子超甲基化作用獲取靜默hMLH1 5且具有比MSI-L及/或MSS CRC更佳之預後。 6-8因此，MSI-H與MSI-L/MSSCRC之間之區別在遺傳學及表型方面較為明顯。 相比而言，儘管MSI-L CRC在hMSH2或hMLH1中不具有缺陷，2但MSI-L之分子基礎在很大程度上尚未可知。
因此，儘管在導致LM之第II期/第III期原發性CRC中MSI-M與SMARCA2R-LOH之間無相關性，但其在異時LM中顯著相關。 相比而言，儘管SMARCA2R-LOH在同時LM中之頻率與在第IV期原發性CRC中發現之頻率相比不存在差異，但在第IV期原發性CRC及同時LM中偵測到MSI-M與SMARCA2R-LOH之間的顯著相關。 因此，MSI-M及SMARCA2R-LOH共存於大部分(70~80%)之第IV期原發性CRC、異時LM或同時LM組織中。 統計學分析：為評估特定CRC組之無復發存活，使用Kaplan-Meier方法。 術語「組織樣本」(術語「組織」與術語「組織樣本」可互換使用)應理解為包括由一或多個細胞個別地或與任何基質複合或與任何化學物質結合而構成之任何物質。
腫瘤級別: TW201300777A – 預測大腸直腸癌轉移復發之生物標記
然而，MSI-L/EMAST及MSH3下調在大腸直腸癌發生中之病理學意義尚未可知。 腫瘤級別2025 腫瘤級別 當本案發明人除NCI標記以外在MSI分析中亦包括含有四核苷酸重複之EMAST標記時，所有MSI-H CRC均在EMAST標記中展現高程度之MSI，且大部分但非所有MSI-L及約一半之MSS CRC在一些EMAST標記中展現MSI。 1,10此外，偶發性CRC中EMAST基因座處之MSI-L及MSI可同樣表明MSH3蛋白損失。 1此等觀察結果引導本案發明人假定MSI-L及/或EMAST CRC(在該研究中稱作中等程度之MSI(MSI-M))可能屬於不同於具有MSI-H之CRC及/或具有高度穩定性微衛星(H-MSS)之CRC的臨床病理組。 本案發明人現已認識到，第II期及第III期原發性CRC中之MSI-M可與轉移至肝之能力相關(異時肝轉移)。 本案發明人分析了98例肝轉移組織(48例異時及50例同時)(圖3A及圖3B)及131例導致LM之轉移性原發性CRC組織(56例第III期及18例第II期及57例第IV期)(圖3C及圖3D)的MSI狀態。
各欄描繪以下：關於7種EMAST標記(MYCL1至S321)、5種具有CA重複之標記(S123至S69)、2種具有單A重複之標記(BAT25及BAT26)的MSI資料。 如本文所用，「核酸」或「核酸分子」係指聚核苷酸，諸如去氧核糖核酸或核糖核酸、寡核苷酸、由聚合酶鏈反應產生之片段及由任何接合、切斷、核酸內切酶作用及核酸外切酶作用產生之片段。 核酸分子可由單體構成，該等單體為天然產生之核苷酸(諸如DNA及RNA)或天然產生之核苷酸之類似物(例如，天然產生之核苷酸的α-對映異構形式)或兩者之組合。 糖修飾包括例如以鹵素、烷基、胺及疊氮基置換一或多個羥基，或糖可經官能化為醚或酯。 此外，整個糖部分可經空間及電子學上類似之結構，諸如氮雜-糖及碳環糖類似物置換。