即，可抑制GST-π之物質成為具有BRAF基因突變之細胞(典型而言為癌細胞)之細胞死亡誘導劑及/或細胞增殖抑制劑之候補物質。 作為此種化合物，可使用有機化合物(胺基酸、多肽或其衍生物、低分子化合物、糖、高分子化合物等)、無機化合物等。 作為多肽之衍生物，可列舉對修飾基加成而獲得之修飾多肽、藉由改變胺基酸殘基而獲得之變異體多肽等。 腦膜癌 進而，此種化合物既可為單一化合物，亦可為化合物基因庫、基因基因庫之表現產物、細胞萃取物、細胞培養上清液、醱酵微生物產生物、海洋生物萃取物、植物萃取物等。
自轉染後第1天起將作為BRAF抑制劑之PLX4720(Selleck公司)以相對於CACO-2成為40μM、相對於SK-MEL-28成為0.7μM、及相對於A2058成為10μM之方式添加至培養基中並培養至第5天為止。 關於PLX4720處理之對照，添加溶劑之DMSO(Dimethyl sulfoxide，二甲基亞碸)(和光純藥)進行培養。 Growth assay(生長測定)係藉由測量轉染後0天起至第5天為止之細胞數而進行。 可是，如上所述，抑制GST-π之藥物對具有BRAF基因突變之細胞表現出細胞死亡誘導及/或細胞增殖抑制。 因此，可將對GST-π之抑制作為指標，對具有BRAF基因突變之細胞之細胞死亡誘導劑及/或細胞增殖抑制劑進行篩選。
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如或之劑，其特徵在於：上述藥物係選自由RNAi(RNA interference，RNA干擾)分子、核酶、反義核酸、DNA/RNA(Ribonucleic Acid，核糖核酸)嵌合聚核苷酸及表現該等中 之至少1種之載體所組成之群中之物質。 投予頻率因所使用之劑或組合物之性狀或包含上述者之對象之條件而有所不同，例如可為1天數次(即1天2、3、4次或5次以上)、1 天1次、每隔數天(即每隔2、3、4、5、6、7天等)、每隔1週、每隔數週(即每隔2、3、4週等)。 作為投予路徑，包含包括經口及非經口之兩者之各種路徑，例如經口、靜脈內、肌肉內、皮下、局部、腫瘤內、直腸、動脈內、門靜脈內、心室內、經黏膜、經皮、鼻內、腹腔內、肺內及子宮內等路徑。 腦膜癌病(meningeal carcinomatosis，MC)是指惡性腫瘤瀰漫性或多灶性軟腦膜播散或浸潤，臨床表現為腦、腦神經和脊髓受損的症狀，為中樞神經系統轉移瘤的一種… 國外大量研究資料證實，未經治療的MC患者症狀不能自行緩解，病程是不可逆的。 化療的途徑包括腰椎穿刺和腦室導管注射，常用藥物有甲氨蝶呤、阿糖胞甘(A-rac)及塞替哌，宜小劑量，多次給藥。
例如，使被檢測物質與作為癌細胞之一例之具有BRAF基因突變之癌細胞接觸，並測定該細胞中之GST-π之表現量。 於與被檢測物質之非存在下測定之表現量相比使被檢測物質接觸時之表現量降低之情形時，可選擇該被檢測物質作為抑制GST-π之藥物之候補物質。 又，進而，可提供一種包含投予有效量之抑制GST-π之藥物之細胞死亡之誘導方法或細胞增殖之抑制方法。 又，藉由調配抑制GST-π之藥物作為有效成分，可製造細胞死亡誘導劑、細胞增殖抑制劑、細胞死亡誘導組合物或細胞增殖抑制組合物。
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再者，於圖1及2中一併表示對細胞數進行測定之結果與利用西方墨點之解析之結果。 如圖1及2所示，關於大腸癌細胞株及黑色素瘤細胞株，於具有BRAF基因突變之癌細胞中，均藉由作為抑制GST-π之藥劑之GST-π siRNA減弱GST-π，藉此細胞增殖能力被顯著地抑制。 BRAF基因中之突變於惡性度較高之腫瘤中被確認到，且已知為大腸癌中無法切除之大腸癌之預後不良因子。 黑色素瘤之患者之一半具有BRAF基因突變，於轉移能力較高之情形時，致死率‧惡性度最高。 根據本實施例之結果暗示，關於此種具有BRAF基因突變之癌，抑制GST-π之藥劑對細胞增殖抑制有效，因此期待將該等與難治性癌之新穎之治療法聯繫起來。 於本實施例中，對使抑制GST-π之藥物作用於具有BRAF基因突變之細胞時之細胞增殖抑制效果進行了研究。
- 載體既可於宿主細胞內複製，亦可無法複製，又，基因之轉錄既可於宿主細胞之核外進行，亦可於核內進行。
- 所謂本說明書所記載之本發明之各種處理方法中之有效量，例如係減少疾病之症狀或使疾病之進行延遲或者停止之量，較佳為抑制或治癒疾病之量。
- 然而，存在因持續投予該抑制劑而導致癌細胞對該抑制劑獲得耐受性之情形，從而治療效果被限定。
- 一種抑制GST-π之產生之藥物之用途，其用於製造起因於具有BRAF基因突變、且對BRAF抑制劑具有耐受性之細胞之增殖異常之疾病之治療用醫藥組合物，上述藥物係選自由RNAi分子、核酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合聚核苷酸及表現該等中之至少1種之載體所組成之群中之物質。
本發明係關於一種針對具有BRAF基因突變之細胞(例如癌細胞之一種)之細胞死亡誘導劑、該細胞之增殖抑制劑及起因於該細胞之增殖異常之疾病之治療用醫藥組合物，進而係關於一種對細胞死亡誘導劑及/或細胞增殖抑制劑進行篩選之方法。 腦膜癌 一種起因於具有BRAF基因突變之細胞之增殖異常之疾病之治療用醫藥之組合，其包含抑制GST-π之產生之藥物，該藥物係選自由RNAi分子、核酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合聚核苷酸及表現該等中之至少1種之載體所組成之群中之物質，且與BRAF抑制劑另外投予。 一種起因於具有BRAF基因突變之細胞之增殖異常之疾病之治療用醫藥組合物，其包含抑制GST-π之產生之藥物，該藥物係選自由RNAi分子、核酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合聚核苷酸及表現該等中之至少1種之載體所組成之群中之物質，且與BRAF抑制劑同時投予。 因此，本發明之目的在於提供一種針對具有BRAF基因突變之細胞具有細胞死亡誘導作用及/或細胞增殖抑制作用之劑，且提供一種起因於細胞增殖異常之疾病之治療用醫藥組合物，且提供一種對細胞死亡誘導劑及/或細胞增殖抑制劑進行篩選之方法。
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又，根據本發明之細胞增殖抑制劑，針對具有BRAF基因突變之細胞，可非常強力地抑制細胞增殖。 腦膜癌 因此，本發明之細胞增殖抑制劑可作為起因於具有BRAF基因突變之細胞之增殖異常之疾病之治療用 之醫藥組合物而發揮非常高之藥效。 根據本發明之細胞死亡誘導劑，針對具有BRAF基因突變之細胞，可非常強力地誘導細胞死亡。
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一種具有BRAF基因突變之細胞之細胞死亡誘導劑及/或細胞增殖抑制劑之篩選方法，其包含選擇抑制GST-π之藥物。 於本實施例中，對使抑制GST-π之藥物及BRAF抑制劑作用於具有BRAF基因突變之細胞時之細胞增殖抑制效果進行了研究。 本說明書所記載之本發明之各種劑或組合物(包含各種醫藥組合物)能以任一形態供給，就保存穩定性之觀點而言，能以可於使用時調製之形態例如於醫療現場或其附近可由醫師及/或藥劑師、護士、或者其他醫務輔助人員等製備之形態提供。 腦膜癌 該形態於本發明之劑或組合物包含脂質或蛋白質、核酸等難以實現穩定之保存之成分時尤其有用。 腦膜癌2025 腦膜癌 於此情形時，本發明之劑或組合物係作為包含該等所必需之構成要素之至少1種之1個或2個以上之容器而提供，且係於使用之前、例如24小時前以內、較佳為3小時前以內、並且更佳為即將要使用之前製備。
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圖2~係表示於具有BRAF基因突變之黑色素瘤細胞株中對GST-π減弱所帶來之細胞增殖抑制效果進行驗證之結果(細胞數測定結果、西方墨點結果)之特性圖。 如之篩選方法，其包含如下步驟：使被檢測物質與癌細胞接觸之步驟；測定上述細胞中之GST-π之表現量之步驟；及於與被檢測物質之非存在下測定之情形時相比該表現量降低之情形時，選擇作為抑制上述GST-π之藥物之步驟。 BRAF基因係對構成RAS-RAF-MAPK路徑之絲胺酸/蘇胺酸激酶之一種進行編碼之基因。 已知具有V600E突變之BRAF使下游之訊號始終活化，即便不存在來自細胞外部之刺激，亦會導致細胞之增殖。 近年來，瞭解到獲得了BRAF抑制劑耐受性之黑色素瘤細胞株與黑色素瘤之再發相關。
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例如上述有效量可為對該細胞集團中之細胞之1%以上、2%以上、3%以上、4%以上、5%以上、6%以上、8%以上、10%以上、12%以上、15%以上、20%以上、進而25%以上等造成細胞凋亡或增殖抑制之量。 報告有若使針對GST-π之siRNA作用於KRAS具有突變之癌細胞系，則Akt之活化被抑制，自噬增大，但細胞凋亡之誘導成為中等程度(非專利文獻11)。 於專利文獻1中揭示有藉由將抑制GST-π之藥物與3-甲基腺嘌呤等自噬抑制劑作為活性成分，可誘導癌細胞之細胞凋亡。 進而，於專利文獻2中揭示有若同時地抑制GST-π與Akt等之表現，則細胞增殖被抑制而誘導細胞死亡且藉由抑制GST-π之表現而誘導之自噬因同時地抑制Akt等之表現而被顯著地抑制。 將與大腸癌細胞株相關之結果示於圖1，將與黑色素瘤細胞株相關之結果示於圖2。
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國外學者(Wasserstrom，1982)推薦的治療方案為經Ommaya囊甲氨蝶呤(或阿糖胞甘)單一給藥與局部放療聯合。 腦膜癌病是惡性腫瘤瀰漫性或多灶性軟腦膜播散或浸潤，為中樞神經系統轉移瘤的一種特殊分佈類型，本病常發生於原發灶確診後數月，數年，也有10餘年者。 但細胞學檢查並非首次都能發現腫瘤細胞，故對臨床高度懷疑MC者需反覆多次做腦脊液細胞學檢查以提高陽性率。
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例如於1次投予使用複數個單位之組合物之情形時，1個單位之組合物中所調配之有效成分之量可設為1次投予所必需之有效成分之量之複數分之一。 可是，將包含麩胱甘肽作為觸媒之酵素之一之麩胱甘肽-S-轉移酶已知為使藥劑等物質與麩胱甘肽偶合而將其製成水溶性之物質之酵素。 GST基於胺基酸序列，被分類為α、μ、ω、π、θ及ζ之6種同功酶作為代表性者。 其中，尤其是GST-π(glutathione S-transferase pi，亦稱為GSTP1)之表現於各種癌細胞中增大，指出其可能會成為對於一部分抗癌劑之耐受性之一個因素。
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因此，本發明亦關於一種包含單獨或者組合包含本發明之各種劑或組合物可包含之活性成分之1個或2個以上之容器之組合物之製備 套組、以及以此種套組之形態提供之各種劑或組合物之必需構成要素。 本發明之套組除上述以外，亦包含記載有本發明之各種劑或組合物之製備方法或投予方法等之指示例如說明書或CD(Compact Disc，光碟)、DVD(Digital 腦膜癌2025 Versatile Disc，數位多功能光碟)等電子記錄媒體等。 又，本發明之套組可包含用以完成本發明之各種劑或組合物之全部構成要素，亦可未必包含全部構成要素。 因此，本發明之套組亦可包含通常可於醫療現場或實驗設施等獲取之試劑或溶劑例如無菌水或生理鹽水、葡萄糖溶液等。 所謂BRAF基因中之突變，意指對野生型BRAF之胺基酸序列之缺失、替換、加成、插入等突變、對BRAF基因之表現控制區域之突變。
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實際上已知若使GST-π過度表現，並使針對GST-π之反義DNA(Deoxyribonucleic Acid，脫氧核糖核酸)或GST-π抑制劑作用於表現出藥物耐受性之癌細胞系，則藥劑耐受性被抑制(非專利文獻4~6)。 進而，於最近之報告中報告有若使針對GST-π之siRNA(Small 腦膜癌2025 interfering RNA，小干擾RNA)作用於使GST-π過度表現之雄性素非依存性前列腺癌細胞系統，則其增殖被抑制，從而細胞凋亡增大(非專利文獻7)。 腦膜癌2025 目前，針對確認到具有V600E突變之BRAF之癌，認為利用針對具有V600E突變之BRAF之抑制劑所進行之治療有效。