利用建構Kaplan-Meier無復發存活及總體存活曲線以求得血清中14-3-3β表現量及病患存活率。 成對學生T檢定(Paired Student’s t test)係用以比較病患在手術前及手術後血清中14-3-3β含量之變化。 腫瘤種類 本實施例中用以作為14-3-3β及癌胚抗原的質體量之診斷工具，利用敏感度對專一性(l-specificity)作圖以偵測不同分期之胃癌(第I~IV期)及正常人，並計算ROC曲線下的面積。 參閱第2b~2d圖，係分別顯示正常組織(第2b圖)、腸道形腫瘤組織(第2c圖)及混合型腫瘤組織(第2d圖)之免疫組織染色結果(放大200倍)。 在腫瘤組織中，14-3-3β係在癌細胞之細胞核及細胞質中呈現陽性染色。 由第2b圖中可看到正常胃部組織中表現出微量的14-3-3β，第2c、2d圖中的腸道形腫瘤組織及混合型腫瘤組織之14-3-3β表現量明顯高於正常胃部組織。
- 雖然，本發明已藉由參考前述較佳實施例而揭露，熟悉本發明技術領域者可輕易的據此做些許的改變或修飾，但此將不脫離本發明申請專利範圍所界定之範疇。
- 成對學生T檢定(Paired Student’s t test)係用以比較病患在手術前及手術後血清中14-3-3β含量之變化。
- 根據世界衛生組織估計，胃癌是全世界排名第四個最普遍被診斷的癌症，而且是所有癌症死亡率排名第二高，被視為國際間重要的健康危機。
- 臨床病理因素包括年齡、性別、腫瘤種類(Borrmann分類)、腫瘤組織學分類(Lauren分類)、腫瘤侵入深度、淋巴結轉移情形、血液侵入及腫瘤大小(腫瘤的長x寬)，參考其組織學發現並紀錄於病患資料庫。
- 基本上，在本發明的測定中，將患者樣品中14-3-3β蛋白質含量與正常樣品中相應的值比較，該正常樣品預先製成表格並提供平均範圍、平均值和標準偏差，或類似表達方式。
蛋白質點以二維電泳分離時，先進行等電點沉澱，以18cm膠條(pH 4-7)於20℃、8000V條件下，以IPGphor(購自Amersham Pharmacia Biotech)共進行91.2KVhr。 接著將膠條轉至12.5%無梯度SDS-PAGE進行二維分離。 所得影像利用ImageMaster software version 6.0(購自Amersham Pharmacia Biotech)進行蛋白質偵測及定性。
腫瘤種類: TWI399541B – 檢測一胃癌預後程度的方法
這些資料庫包含胜肽、類胜肽肽模擬物、核酸，對14-3-3β表現具抑制效果之小分子或其他藥物。 適合的胃癌細胞系之實例包括AGS細胞株、KATO 腫瘤種類 III細胞株、TSGH細胞株、SC-M1細胞株、及N87細胞株。 個體體內之14-3-3β表現量可在活體內或活體外測定，例如，14-3-3β量可在體外藉得自個體之生物樣本而測定，如投藥化合物前及後之腫瘤固體組織樣本、排泄物、血液或消化液。 腫瘤種類2025 化合物治療胃癌的能力可在活體內藉投藥化合物至罹患胃癌之動物並測定此化合物對腫瘤大小，生長或轉移潛力之影響而確認。
- 結果參閱第4a~4e圖，其中第4a圖為第I期胃癌患者的14-3-3β(第4a圖)及CEA(第4a圖)之ROC曲線，第4a圖係顯示第I期胃癌病患14-3-3β之AUC值為0.75。
- 正常樣品可以來自與患者樣品同種組織，或不同組織類型，獲得該正常樣品的健康個體可以選擇與患者具有相符合的特徵，例如年齡、性別、種族等。
- 血液樣品係在手術前取自145位胃癌病患、63位控制組人員(38位男性及25位女性，平均年齡在46.2歲)，包括19位經內視鏡診斷為胃炎患者，19位非胃炎性消化不良者，及25位無胃部異常的自願者。
- 蛋白質萃取及西方墨點法分析 組織樣品在取下後立即以液態氮冷凍保存。
- 本發明所使用的「分期」，係指依據胃癌之原始腫瘤大小，局部淋巴腺轉移的有無，以及遠處轉移的與否，分為0(原位癌)、I(又可分成IA、IB)、II、III(又可分成IIIA、IIIB)、IV五個等級。
- 蛋白質點以二維電泳分離時，先進行等電點沉澱，以18cm膠條(pH 4-7)於20℃、8000V條件下，以IPGphor(購自Amersham Pharmacia Biotech)共進行91.2KVhr。
本發明所使用的「分期」，係指依據胃癌之原始腫瘤大小，局部淋巴腺轉移的有無，以及遠處轉移的與否，分為0(原位癌)、I(又可分成IA、IB)、II、III(又可分成IIIA、IIIB)、IV五個等級。 本發明所使用的「分離的」，係指多肽或蛋白質，是基本上從其自然環境成分中分離出。 較佳分離的多肽或蛋白質是一種與其天然環境成分相比至少百分之九十五重量以上的相同的多肽或蛋白質構成，最佳是該分離的多肽或蛋白質為同質組合物，通過基於分子量和等電點的二維電泳常規分離，其能夠被分辨成單個的點。 腫瘤種類2025 通過常規的二維電泳分離對本發明所屬技術領域中通常知識者是習知的。 本發明所使用的「器官侵犯」，係當腫瘤直接侵入至少一個周邊結構例如十二指腸、食管、肝臟、結腸系膜或橫隔膜。
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實施例4 各分期胃癌患者與正常人之14-3-3β及癌胚抗原間的關 連性 為分析14-3-3β及臨床結果間的關連性，在此將病患根據臨床及病理參數，分為不同組別。 學生T檢定(Student’s t test)用以比較兩獨立母群的差異性。 在多個群組間比較時，係利用one-way ANOVA(SAS 腫瘤種類2025 9.1 software)。
雖然，本發明已藉由參考前述較佳實施例而揭露，熟悉本發明技術領域者可輕易的據此做些許的改變或修飾，但此將不脫離本發明申請專利範圍所界定之範疇。 腫瘤種類 其既包括判斷疾病的特定後果(如康復、某種症狀、體徵和併發症等其它異常的出現或消失及死亡)。
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本發明所使用的「腫瘤遠處轉移」，係指腫瘤細胞從原始發生的部位經由侵入循環系統，轉移到身體其他部位繼續生長的過程，也稱作惡性轉移。 本發明所使用的「腫瘤浸潤」，是指惡性腫瘤細胞在質和量方面異常地分佈於組織間隙的現象，如腫瘤細胞粘連、酶降解、移動、基質內增殖等一系列過程的表現。 腫瘤種類2025 本發明所使用的「進行性胃癌」，係指癌細胞侵犯已超過黏膜下層，侵入胃壁肌肉層、或穿出胃壁肌肉層(固有肌肉層)，甚至侵犯到胃周圍的局部淋巴結。 蛋白質萃取及西方墨點法分析 組織樣品在取下後立即以液態氮冷凍保存。
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較佳地，正常樣品中關於14-3-3β蛋白質含量是與患者樣品中相應值，基本上相同的實驗條件下獲得。 正常樣品可以來自與患者樣品同種組織，或不同組織類型，獲得該正常樣品的健康個體可以選擇與患者具有相符合的特徵，例如年齡、性別、種族等。 基本上，在本發明的測定中，將患者樣品中14-3-3β蛋白質含量與正常樣品中相應的值比較，該正常樣品預先製成表格並提供平均範圍、平均值和標準偏差，或類似表達方式。 本發明所檢測抑制14-3-3β的化合物，可以用數種已熟知的組合資料庫方法獲得。
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故可從免疫組織染色實驗中再次確認腫瘤組織中14-3-3β表現量高於正常組織的結果。 目前來說，胃癌診斷上有一些腫瘤標記陸續被發現，例如癌胚抗原、CA19-9、CA72-4(carbohydrate antigen 72-4)，但許多研究指出此些腫瘤標記對胃癌診斷上的敏感度及專一性都不高，往往造成診斷上的誤判及困難。 因此，具有高敏感度及專一性的生物標記，對於加強胃癌病患的早期偵測及診斷都具有極大的價值。 組織及血液樣品 本發明所有人類組織樣品及血清樣品皆經由人體試驗委員會所核准。 本實施例中使用之40對腫瘤及正常組織的樣品皆是在手術後30分鐘取得後即保存於液態氮中。 如申請範圍第1項所述之方法，其中檢測該血清樣品中 β含量是使用蛋白質分析方法，係為一西方墨點法。
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實施例2 比較胃腫瘤與正常組織之14-3-3β表現量差異 本實施例中所使用的胃組織係以40對腫瘤及正常組織作為對照。 本發明所使用的「組織樣品」或「生物樣品」或「患者樣品」或「患者細胞或組織」，皆是指從患者的組織中獲得相似的細胞集合。 組織樣品的來源可以是新鮮、冷凍及/或保存的器官或組織樣品；血液或任何血液成分；體液如腹水或組織液。 定義 發明所使用的「腫瘤標記」，係指與惡性腫瘤細胞相關之特殊蛋白質，由癌症細胞本身釋放到血液中或為癌症細胞誘發其他細胞釋放出的特殊蛋白質，在癌症發生時逐漸地在人體血液中升高。
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而當以血清中14-3-3β含量之決定最佳診斷的截斷點cut-off point為329ng/ml作為胃癌之早期偵測指標時，其敏感度為82%，而專一性為65%。 而四個不同時期的胃癌中，14-3-3β之AUC值皆高於癌胚抗原，顯示出14-3-3β測定胃癌比癌胚抗原更準確，更適於作為診斷指標。 實施例6 在細胞中過度表現14-3-3β與腫瘤侵入、轉移及生長之關係 腫瘤種類2025 將人類胃癌細胞TSGH、SC-M1、N87、AGS及KATO III，以前述之方法步驟進行細胞培養以及西方墨點法分析。 結果如第6a圖所示，其顯示出各種不同胃癌細胞之內生性14-3-3β表現量，其中TSGH細胞具有最高的14-3-3β表現量。
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另外，基於上述方法可發展出一種檢測套組，包含一有效量之14-3-3β抗體，用於檢測胃癌有發展為腫瘤侵入或遠處轉移之危險性。 本發明之又一目的即是提供一種檢測套組，係包含一有效量之14-3-3β抗體，用於檢測胃癌有發展為腫瘤侵入或遠處轉移之危險性。 檢測一胃癌預後程度的方法 本發明係關於一種偵測預後程度的方法，特別是關於一種檢測一胃癌預後程度的方法。 本發明所使用的「胃癌」，係指由人體胃部的黏膜細胞不正常的繁殖與增生所形成，例如胃腺癌即是最常見的胃部惡性腫瘤。 14-3-3是一種酸性蛋白，大小約25-30kDa，主要存在於腦部和神經系統中，也在心、肝、腎、小腸和睾丸等組織中表達，也有少數存在於細胞膜、細胞核以及高爾基體、線粒體、葉綠體等細胞器中。 在哺乳類動物中具有至少七種亞型，分別是β、γ、ε、σ、ζ、τ、η，而其中β及γ的磷酸型則分別被命名為α、δ亞型。