為檢測抗-Globo H抗體之特異性及相對效價，混合各組醣類共軛珠粒，並各自以1：50稀釋。 然後將50μL珠粒混合物轉移至V型底96孔盤，並與50μL以1：1000稀釋之血清或1μg/mL 腫瘤照片 MZ-2抗體混合。 培育30分鐘後，用150μL清洗緩衝液清洗珠粒，並另外用100μL PE-共軛2Ab染色。
更特定言之，本發明係關於抗免疫原性醣肽之抗體，含該抗體之醫藥組合物及其於癌症療法中之用途。 在RPMI 1640培養基中，將MCF-7、TOV21G Globo H(+)及HPAC細胞調整為2 x 106個細胞/mL，並將50μL稀釋細胞之等分試樣添加至流管中。 在RPMI 1640培養基中，將嵌合MZ-2抗體稀釋至2x指定濃度，並將50μL等分試樣添加至各具有癌細胞之流管中。
此發明內容並非本發明之詳盡概述，且其並未明確本發明之關鍵/決定性元素或描述本發明之範圍。 其唯一目的係簡單呈現本文所揭示之一些概念，作為稍後呈現之較詳細描述之引子。 除非另有規定，否則在本文所用肽記法中，按照標準用法及習慣，左手方向係胺基酸(N端)方向，且右手方向係羧基端(C端)方向。
在另一實施例中，抗體或抗體片段可自利用已知之習知技術產生之抗體噬菌體集合庫中單離；例如使用噬菌體集合庫分別單離鼠科及人類抗體。 後續公開案描述藉由鏈改組生產高親和力(nM範圍)人類抗體、以及組合感染及活體內重組作為構築極大型噬菌體集合庫之策略。 因此，此等技術係用於單離單株抗體之習知單株抗體融合瘤技術之可行替代。 在一態樣中，本發明提供一種輕鏈可變區，其包括選自由SEQ ID NO：10至13組成之群之L-CDR1、選自由SEQ ID NO：14至16組成之群之L-CDR2及選自由SEQ ID NO：17至19組成之群之L-CDR3。
- 吾人進一步藉助使CDR及位於CDR側面之框架序列選擇性突變改良其結合親和力。
- 如本文所使用之術語「抗體」係指能識別或結合抗原之完整抗體分子或者其片段、變異體或衍生物。
- 本文將相對於此序列之一致性或相似性定義為在比對序列及視需要引入空隙以實現最大百分比之序列一致性後，候選序列中之胺基酸序列與物種依賴性抗體殘基一致(亦即，相同殘基)或相似(亦即，基於常見側鏈性質來自相同族群之胺基酸殘基，參見下文)之百分比。
- 在如本文所述之抗-Globo H抗體或其抗原結合部分或包含如本文所述之抗-Globo H抗體或其抗原結合部分之醫藥組合物可保護免於在腸中滅活之程度而言，亦涵蓋口服投與形式。
- 利用習知程序(例如，藉由使用能特異性結合至編碼單株抗體之重鏈及輕鏈之基因的寡聚核苷酸探針)很容易單離及定序編碼單株抗體之DNA。
- 在另一實施例中，該 人源化抗-Globo H抗體或其抗原結合部分包括包含由SEQ ID NO：27組成之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含由SEQ ID NO：75組成之胺基酸序列的輕鏈可變區(hMZ-2Lw抗體)。
- 就此而言，任何內容均不應視為承認本發明者無權因為是先前發明或因為任何其他原因而先於此等揭示內容。
另一方法使用衍生自輕鏈或重鏈之特定子群之所有人類抗體之共有序列之特定框架。 非人類胺基酸殘基通常稱為「輸入」殘基，且通常取自「輸入」可變域。 通常可按照此項技術中已知之習知方法，藉由用嚙齒動物CDR群或CDR序列取代人類抗體之相應序列進行人源化。 因此，此等「人源化」抗體係其中實質上少於完整之人類可變域已經被非人類物種之相應序列取代之抗體。 在操作時，人源化抗體通常係其中一些CDR殘基及可能一些FR殘基經非人類(例如，嚙齒動物)抗體中類似位點之殘基取代之人類抗體。
典型劑量包括(例如)5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg及30mg/kg。 就在幾天或更長時間內重複投與而言，依據病狀，治療持續至(例如)癌症得到治療，其係由上文所述或此項技術中已知之方法測量。 在另一態樣中，本發明提供一種治療及/或預防癌症之方法，其包括向有此需要之個體投與治療上有效量之如本文所述之抗-Globo H抗體或其抗原結合部分或包含如本文所述之抗-Globo H抗體或其抗原結合部分之醫藥組合物。
將一百微升細胞轉移至轉移盤之插片中，並在CO2培養箱中培育24小時。 圖14顯示，MZ-2抗體抑制表現Globo H之TOV21G細胞之遷移。 藉由Biolayer干涉儀，使用FortrBio OcTet系統檢測抗-Globo 腫瘤照片2025 H抗體之結合親和力。 簡而言之，首先將感測器浸泡於20μM生物素化Globo H中，以將Globo H塗佈於其表面上。 將MZ-2純系(mMZ-2)、小 鼠-人類嵌合MZ-2純系(cMZ-2)及人源化MZ-2純系(hMZ-2L、MK-1或hMZ-2Lw)連續稀釋至1333、444.4、148.1、49.4及16.5nM，並分別與塗佈Globo H之感測器培育。
吾人進一步藉助使CDR及位於CDR側面之框架序列選擇性突變改良其結合親和力。 藉由電穿孔將人源化構築體進一步轉染至FO細胞中，並藉由相關抗生素篩選以產生穩定表現純系。 為獲得大規模hMZ-2抗體進行活體內抗腫瘤分析，首先將1 x 106個hMZ-2表現FO細胞i.p.注射至NOD/SCID小鼠中。
例如，具有SEQ ID NO：27之重鏈可變區及SEQ ID NO：231之輕鏈可變區的抗體之KD值係在1 x 10-7至1 x 10-10nM之範圍內。 片語「醫藥上可接受的」係指彼等在合理範圍的醫療判斷下適於與人類及動物組織接觸而無過度毒性、刺激性、過敏反應或其他問 題或併發症，且符合合理的效益/風險比之化合物、材料、組合物及/或劑型。 各載劑必須在與調配物之其他成分相容之意義上係「可接受」且對患者不會造成傷害。 腫瘤照片2025 術語「賦形劑」、「載劑」、「醫藥上可接受之載劑」及類似用語在本文中可互換使用。 如本文所使用，「抗體突變體」或「抗體變異體」係指物種依賴性抗體之胺基酸序列變異體，其中物種依賴性抗體之一或多個胺基酸殘基已經修飾。
如請求項1之單離之抗-Globo H抗體或其抗原結合部分，其包含重鏈可變區，其包含相對於SEQ ID NO：147或150之胺基酸序列具有至少85%一致性之胺基酸序列，及輕鏈可變區，其包含相對於SEQ ID NO：195或198之胺基酸序列具有至少80%一致性之胺基酸序列。 如本文所使用之術語「抗體」係指能識別或結合抗原之完整抗體分子或者其片段、變異體或衍生物。 輕鏈包括一個可變域及一個恆定域；而重鏈包括一個可變域及三個恆定域(CH1、CH2及CH3，統稱為CH)。 VH及VL區可進一步細分為具有超變性之區域，稱為互補決定區，其間穿插有較保守之區域，稱為框架區。
2週後收穫此等小鼠之腹水，並通過蛋白質G瓊脂糖管柱來純化所產生之抗體。 將hMZ-2抗體、hMz-2Lw(重鏈可變區：SEQ ID No.27；輕鏈可變區SEQ ID No.75)及MK1(重鏈可變區：SEQ ID 腫瘤照片 No.290；輕鏈可變區SEQ ID No.135)用於以下實例中。 在一些實施例中，將如本文所述之抗-Globo H抗體或其抗原結合部分或包含如本文所述之抗-Globo H抗體或其抗原結合部分之醫藥組合物投與至患有癌症之個體，該癌症欲藉由全身遞送該製劑或遞送至所需表面或目標之任何投與模式抑制，且投與模式可包括(但不限於)注射、輸注、滴注及吸入投與。 在如本文所述之抗-Globo H抗體或其抗原結合部分或包含如本文所述之抗-Globo H抗體或其抗原結合部分之醫藥組合物可保護免於在腸中滅活之程度而言，亦涵蓋口服投與形式。 「注射」包括(但不限於)靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、室內、囊內、眼窩內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蜘蛛膜下、脊柱內、大腦脊柱內及胸骨內注射及輸注。 在一較佳實施例中，用於本文所述方法中之如本文所述之抗-Globo H抗體或其抗原結合部分或包含如本文所述之抗-Globo H抗體或其抗原結合部分之醫藥組合物係藉由靜脈內輸注或注射投與。
- 此外，可變區之定點或高密度突變可用於優化單株抗體之特異性、親和力等。
- 另一方法使用衍生自輕鏈或重鏈之特定子群之所有人類抗體之共有序列之特定框架。
- 如本文所使用，術語「治療上有效量」係指活性組分足以產生期望治療反應之量。
- 術語「嵌合抗體」係指包含一個來自一來源或物種之可變區及至少一部分衍生自不同來源或物種之恆定區之抗體，其通常係藉由重組DNA技術製備。
- 在處理後24天時，提供hMZ-2Lw抗體之小鼠中之腫瘤幾近消失。
在另一實施例中，該人源化抗-Globo H抗體或其抗原結合部分包括包含由SEQ ID NO：90組成之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含由SEQ ID NO：135組成之胺基酸序列的輕鏈可變區(MK1抗體)。 如本文所述，蛋白質/多肽之胺基酸序列之少量變動視為被當前所揭示及主張之發明概念所涵蓋，只要胺基酸序列之變動保持至少80%，諸如至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。 基因編碼之胺基酸通常分成以下家族：酸性天冬胺酸、榖胺酸；鹼性離胺酸、精胺酸、組胺酸；非極性丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸；及不帶電極性甘胺酸、天冬醯胺、穀胺醯胺、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸。
將人類IgG(Fitzgerald，31-AI06)稀釋至相同濃度作為對照。 15分鐘後，將100μL來自健康人類提供者之正常人類血清添加至各管中，並在37℃下培育2小時。 用完全培養基清洗細胞一次，並再懸浮於200μL具有0.5μg/mL之碘化丙錠之完全培養基中。 如本文所使用之片語「非經腸投與」及「經非經腸投與」係指 不同於經腸及局部投與之投與模式，通常藉由注射。
圖9A及B顯示本發明hMZ-2Lw及MK1抗體對MCF-7細胞(乳癌細胞株)之抗原依賴性細胞介導之細胞毒性活性。 所有確定之專利案及其他公開案明確地以引用的方式併入本文中，目的在於描述及揭示(例如)可與本發明相關之此等公開案中所述方法。 腫瘤照片2025 提供此等公開案僅係為了引用其先於本申請案之申請日期之揭示內容。 就此而言，任何內容均不應視為承認本發明者無權因為是先前發明或因為任何其他原因而先於此等揭示內容。 所有關於日期之陳述或關於此等文件之內容之表述係基於本申請者可獲得之資訊，且並非以任何方式承認該等日期或此等文件之內容之正確性。 圖8顯示，濃度高於約10及20μg/ml之hMZ-2Lw抗體在人類胰臟癌細胞株HPAC中產生劑量依賴性細胞毒性。
圖3顯示，MZ-2抗體之特異性係由MZ-2及嵌合MZ-2抗體僅結合至Globo 腫瘤照片 H-共軛珠粒，但不結合至SSEA3-或SSEA4-共軛珠粒之事實指示。 提供以下實例來闡述本發明之某些態樣及協助熟習此項技術者實施本發明。 無需進一步詳述，據信熟習此項技術者基於本文描述即可最大限度使用本發明。
圖7顯示，濃度高於約10及20μg/ml之hMZ-2Lw抗體在人類卵巢癌細胞株TOV21G中產生劑量依賴性細胞毒性。 圖6顯示，含超過1.6μg/ml hMZ-2Lw抗體之人類血清在乳癌MCF-7細胞中引起補體依賴性細胞毒性。 其中在用程式比對A與B時，X係藉由序列比對程式BLAST記為一致匹配之胺基酸殘基之數量，且其中Y係A或B中胺基酸殘基之總數量，以較短者為準。 腫瘤照片 圖1A至E說明細胞結合分析之結果(A：同型物；B：VK9；C：MZ-2；D：對照血清；E：α-Globo H血清)。